多重荧光免疫组化实验相关技术问答（三）

Q1：我该如何得到完美的多色结果呢？

A1：首先，您需要有质量不错的样本和抗体，这就已经是成功的一半（样本、抗体选择攻略），对于样本来说，脱片是我们需要预防的“头号公敌”，多色实验需要重复热修复洗脱抗体多次，假如片子脱片，轻则成像模糊，重则组织脱落前功尽弃，可以在开始实验之前先模拟几轮热修复，不加抗体和其他试剂，看看组织是否有脱落的迹象，如果脱落比较严重，则需要重新制备切片，如果有轻微脱片，则可以考虑购买抗体洗脱液，替代热修复的过程；然后，就可以开始做实验了，我们建议您先进行抗体和染料工作条件摸索，再上多染（参考下图流程），这样多染的成功率可以达到90%以上哦！（小爱经验之谈，即便是染了千百遍的常见指标，换个样本，染色效果就可能天差地别，有条件还是建议要做预实验。）
 

最后的10%，就需要调整指标与染料搭配以及染色的顺序了。

Q2：有没有推荐的染料搭配和染色顺序呢？
 

A2：染料搭配一般遵循“寡靶配强光，众靶配弱光”的原则，意思是表达比较弱的指标搭配荧光信号比较强的染料，表达相对强的指标搭配信号比较弱的染料，Absin的TSA染料波长越短荧光强度越强，比如说需要染PD-1，CD8和CD3，我们手里有一个四色试剂盒（TSA520/TSA570/TSA650），通过IHC发现样本中PD-1的信号很少，CD3信号非常多，其次是CD8，于是选择TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比较合理。
 

接下来就是怎么安排染色先后顺序：

1）划分细胞定位，先外后内：确定每个指标的细胞定位，膜表达先染，胞浆或者胞核的后染（如果是指标比较多的情况下，胞内指标排在比较后面，经过前期多轮洗脱，可以不做细胞通透；如果指标很少，染胞内指标之前还是需要打孔，多个胞内指标也只需要打一次孔）；
2）确定抗原修复方式，先酸后碱：碱修复比酸修复的力度会更强，个别抗体在用碱修复以后会染出来很多非特异性，所以如果是相同的细胞定位，就先染酸修复，再染碱修复的抗体；
3）根据IHC结果判别，先弱后强：组化结果显示指标比较少，比较弱的，排在前面染，理论上来说越靠前染的指标效果会越接近单标染色。
 

以上就是一些通用规则，但不同的指标还是可能出现变化，要想得到最完美的结果，就需要不同的排列组合一个一个尝试（如下表，“X”代表有信号），这样会比较耗费时间和试剂，您可以根据通用规则先行一次多染，然后各通道跟荧光单染做对比，如果效果差别很大，那就再调整染色顺序，如果单染的结果跟组化差别比较大（出现高背景，非特异性明显），就要考虑更换染料搭配。
 

Q3：我成像完了以后想要做数据分析，你们有什么软件推荐吗？
 

A3：目前市面上数据分析软件还是比较多的，像免费的您可以下载imageJ、Qupath，缺点就是用法都需要您自行摸索；我们公司安装的是HALO和StrataQuest两款软件，HALO是付费的，StrataQuest是我们TG的扫描仪平台自带的，从功能、分析的精准度和可操作性来说，肯定是大大优于开源软件的，且有软件专业的技术支持团队能够答疑解惑。您可以根据您的实际情况选择合适的分析软件，如果您实在无从下手，也可以找Absin，我们可以提供数据分析的服务~