空间转录组测序的应用：原发性肝癌空间结构综合分析
期刊：Science Advances（IF 14.98）
测序技术：空间转录组测序
导语
原发性肝癌（PLC）是死亡率第二高的肿瘤，其中肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC）是两种主要的组织学亚型。病因包括慢性肝炎病毒感染、过度应激、药物性肝损伤、黄曲霉毒素 B 暴露、未解决的炎症和复杂性TME，都可能导致 PLC 的高度肿瘤内异质性。到目前为止，PLC几乎没有有效的非手术策略，并且缺乏有效的治疗干预的特定药物靶点。只有有限比例的HCC患者可以从现有的酪氨酸激酶抑制剂药物（如索拉非尼）和免疫检查点抑制剂中受益，这主要是由于肿瘤间和肿瘤内异质性。
科学问题
不同的 PLC 肿瘤生态系统提供了新的见解，并对癌症干预具有潜在的益处。
科学技术
利用10x Genomics Visium平台对这些切片进行空间转录组测序。
研究内容
异质性是癌症预防和治疗的主要挑战。该研究首先构建了原发性肝癌(PLC)的高分辨率空间转录组图谱，包含来自7名患者21个组织中的84,823个spot。将空间肿瘤微环境(TME)特征从非肿瘤区、边缘区到肿瘤区进行渐进式比较，发现肿瘤包膜可能影响肿瘤内空间簇连续性、转录组多样性和免疫细胞浸润。在局部，该研究发现在100mm宽的簇-簇边界上的双向配体-受体相互作用有助于维持肿瘤内结构，而PROM1+和CD47+肿瘤干细胞龛位与TME重塑和肿瘤转移有关。最后，该研究提出了一种TLS-50标记，用于在空间上精确定位三级淋巴样结构(TLS)，并揭示了TLS的独特组成是由它们与肿瘤细胞的距离决定的。
研究路线图
研究结果
1. 利用空间转录组对原发性肝癌的结构探索
对于本研究中的Visium空间基因表达解决方案，根据 H&E 图像显示，每个Spot直径达到 55 μm，捕获大约 8-20 个细胞。测序数据显示，每个点的基因中位数约为3000个。一般来说，肿瘤区域的 UMI 数量大于正常区域的数量，这与之前的研究一致。为了验证转录组学特征是否与组织学信息一致，我们将 H&E 染色图像与其对应的 ST 数据进行了比较。结果证实，由细胞类型标记基因表达定义的区域与病理图像高度一致。具体而言，ALB和CYP2E1在正常区域高表达；肿瘤区域中的 GPC3 和 ARK1B10高表达；KRT19 在胆管癌区域高表达；COL1A1 在被膜和间质区域高表达。
2. 原发性肝癌空间异质性的不同表型
为了表征原发性肝癌的空间多样性，该研究将来自每个患者不同部位的spot进行了聚类分析，并用UMAP展示。该研究发现HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T中的聚类具有区域分布特征，而HCC-2T和cHC – 1T中的聚类是相互交织的。HCC-3L中的Cluster 5是一个独特的Cluster，在HCC-3N和HCC-3T中都没有出现。
该研究还使用基于基因的策略来比较不同亚群中不同细胞类型的得分。值得注意的是，间质区域的成纤维细胞和内皮细胞评分明显较高，不同肿瘤簇区域的免疫细胞评分表现出高度的多样性。通过拟合细胞类型得分的变化曲线（包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、髓系细胞、内皮细胞和成纤维细胞），该研究发现与基质区域相关的簇状细胞形成了成纤维细胞、内皮细胞甚至免疫细胞的变异表型：T细胞、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞的变异模式是高度相似的，而NK细胞和髓细胞是高度变异的。
3. 肿瘤边缘微环境特征
HCC-1、HCC-3和HCC-4中的肿瘤边缘&肿瘤组织切片的肿瘤区域具有更高的空间连续性和更低的转录组多样性。包膜完整的肿瘤组织具有较高的空间连续性和较低的转录组多样性，其完整性与肿瘤细胞的空间异质性及其周围间质和免疫细胞的分布密切相关。基因组变异分析发现，包膜完整性对正常和肿瘤区域的信号通路活性影响不大。
4. 原发性肝癌肿瘤内部异质性
通过每个肿瘤Cluster的标志通路活性的分层聚类分析，确定出两个模块，Module-1 显示细胞周期和代谢相关通路的高活性；而 Module-2 在炎症、血管生成和上皮-间质转化方面具有更高的活性。HCC-1的肿瘤Cluster属于两个不同的模块，T.2（在HCC-1T中代表Cluster2）为模块2，T.5&6（在HCC-1T中代表Cluster5&Cluster6）为模块1。从空间转录组数据推断出的拷贝数变异大多与WES数据一致，这表明从空间转录组数据推断出的拷贝数变异是可靠的。而且空间转录组数据在不同肿瘤簇之间产生了更微妙的拷贝数异质性。这些结果表明肿瘤内存在广泛的空间异质性，某些肿瘤的不同亚群具有不同的通路活性和不同的细胞起源，不同亚群的细胞通讯可能对肿瘤的生态和进化至关重要。
5. 原发性肝癌异质性肿瘤干细胞（CSC）的功能分析
CSCs被认为是肝癌肿瘤内异质性的重要因素。不同的肿瘤干细胞标记物所定义的不同细胞亚群可能包含不同的致癌驱动因子。在这里，该研究集中探讨了五种常用的肝癌干细胞相关标志物(CD47、EPCAM、KRT19、PROM1和SOX9)。对于每个标记物（marker），将每个患者肿瘤spot中表达量最高的前5%的spot定义为标记物阳性的CSC生态位。通过比较L/T/P部分CSC生态位的比例，该研究发现在HCC-2中，CD47-、SOX9-和PROM1阳性的比例逐渐增加，而EPCAM或KRT19基因并没有表现出这样的现象。
6. 三级淋巴结构（TLS）的空间分布及临床特征
TLS是一种异位的淋巴结构，为DC的成熟、抗原呈递以及T和B细胞的激活和分化提供了一个区域，这与抗肿瘤免疫反应和潜在的免疫治疗反应有关。在这里，该研究注意到HCC-5的cluster 6具有高表达CXCL13、CCL19、CCL21、LTF、LTB、CD79A/B等的特征，这些都是TLS形成的必要分子。通过与H&E染色相结合分析，cluster6被鉴定为TLS区域。该研究选择了cluster6中高特异性表达的前50个基因（TLS-50）作为特征基因，并测试了其识别TLS的能力。病理学家证实，与其他信号(包括乳腺癌、12-趋化因子、T辅助性1和B细胞、T滤泡辅助性细胞、CXCL13和浆细胞信号)相比，TLS-50可以识别信号噪声比更高的TLS区域。通过使用TLS-50定位不同切片的TLS点，该研究发现它们主要存在于L切片而不是T和N切片，尤其是在L切片的非肿瘤区域。
参考文献：
Wu R, Guo W, Qiu X, Wang S, Sui C, Lian Q, Wu J, Shan Y, Yang Z, Yang S, Wu T, Wang K, Zhu Y, Wang S, Liu C, Zhang Y, Zheng B, Li Z, Zhang Y, Shen S, Zhao Y, Wang W, Bao J, Hu J, Wu X, Jiang X, Wang H, Gu J, Chen L. Comprehensive analysis of spatial architecture in primary liver cancer. Sci Adv. 2021 Dec 17;7(51):eabg3750. doi: 10.1126/sciadv.abg3750. Epub 2021 Dec 17. PMID: 34919432; PMCID: PMC8683021.
