甲基化研究oxRRBS+RRBS揭示炎症性肠病导致发育异常的表观遗传机制
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2020年12月31日，美国明尼苏达大学Natalia Y. Tretyakova教授团队在《Int J Mol Sci》杂志发表题为“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）揭示炎症性肠病 (IBD)导致基因组中甲基化和羟甲基化模式变化，表明了IBD导致发育异常的表观遗传机制。
标题：Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model （Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中炎症性肠病诱导增生/发育异常的多组学表征）
时间：2020-12-31
期刊：International Journal Of Molecular Sciences
影响因子：IF 6.208
技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
假设表观遗传失调在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和结肠癌发展之间的关联中发挥作用。本研究对从肝螺杆菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收获近端结肠组织，并进行DNA甲基化组、DNA羟甲基化组和转录组分析。RRBS和oxRRBS分析共鉴定出1606个差异甲基化区域（DMR）和3011个差异羟甲基化区域（DhMR），与胃肠疾病、炎性疾病和癌症相关的基因和这些DMR/DhMR重叠。RNA-seq揭示了许多与炎症和癌症相关的基因显著表达变化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在内的几个基因在DNA甲基化/羟甲基化和基因表达水平上均表现出变化。总体而言，本研究结果表明，慢性炎症会引发基因组中DNA甲基化和羟甲基化模式的变化，从而改变关键肿瘤发生基因的表达，并可能导致结直肠癌的发生。
项目设计：
（1）样本选取：
IBD与正常小鼠近侧肠道组织的5mC、5hmC、表达图谱分析
（2）项目设计流程图：
实验结果
（1）肝螺杆菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠结肠组织的组织病理学分析
（2）炎症性肠病（IBD）诱导的增生/发育异常中DNA甲基化和DNA羟甲基化表征
图2：差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）富集的基因在与癌症发生和胃肠疾病相关的基因富集。
（3）差异甲基化分析揭示IBD诱导的增生/发育异常中存在广泛的DMR和DhMR
图3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus诱导炎症在单核苷酸分辨率下的甲基化和羟甲基化动态变化
表1：H.hepaticus诱导的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎症CpG位点IPA差异甲基化和羟基甲基化的经典通路
（4）IBD诱导增生/发育异常中的基因表达变化
（5）DNA甲基化异常调控差异表达基因的综合分析
A. DNA表观遗传标记在IBD诱导的结直肠癌（CRC）发生中的作用的模型。
总结：
本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分别绘制了IBD诱导的DNA羟甲基化和DNA甲基化在全基因组中的变化。同时结合RNA-seq基因表达分析，研究结果首次全面揭示了结肠炎症诱导的表观遗传学变化，为进一步研究IBD生物标志物的发现提供了有用的信息，并有可能促进IBD新疗法的未来发展。
参考文献：
Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.
2020年12月31日，美国明尼苏达大学Natalia Y. Tretyakova教授团队在《Int J Mol Sci》杂志发表题为“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）揭示炎症性肠病 (IBD)导致基因组中甲基化和羟甲基化模式变化，表明了IBD导致发育异常的表观遗传机制。
时间：2020-12-31
期刊：International Journal Of Molecular Sciences
影响因子：IF 6.208
技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
假设表观遗传失调在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和结肠癌发展之间的关联中发挥作用。本研究对从肝螺杆菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收获近端结肠组织，并进行DNA甲基化组、DNA羟甲基化组和转录组分析。RRBS和oxRRBS分析共鉴定出1606个差异甲基化区域（DMR）和3011个差异羟甲基化区域（DhMR），与胃肠疾病、炎性疾病和癌症相关的基因和这些DMR/DhMR重叠。RNA-seq揭示了许多与炎症和癌症相关的基因显著表达变化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在内的几个基因在DNA甲基化/羟甲基化和基因表达水平上均表现出变化。总体而言，本研究结果表明，慢性炎症会引发基因组中DNA甲基化和羟甲基化模式的变化，从而改变关键肿瘤发生基因的表达，并可能导致结直肠癌的发生。
项目设计：
（1）样本选取：
IBD与正常小鼠近侧肠道组织的5mC、5hmC、表达图谱分析
（2）项目设计流程图：
实验结果
（1）肝螺杆菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠结肠组织的组织病理学分析
图1：炎症性肠病（IBD）与正常组织的组织病理学检验
A. 动物研究设计：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在6-7周龄时H.hepaticus感染或无菌培养基处理（对照），并在感染后20周处死
B. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和仅用盐水处理的对照小鼠（蓝色）的结肠组织的组织病理学结果：通过对胃肠道不同部位的炎症、水肿、上皮缺陷、隐窝萎缩、增生和发育异常（Dysplasia）的个体评分求和来计算组织学活性指数（n=7）
C. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲肠每组n=4，横结肠每组n=3，近端和远端结肠每组n=7）
D. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平
B. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和仅用盐水处理的对照小鼠（蓝色）的结肠组织的组织病理学结果：通过对胃肠道不同部位的炎症、水肿、上皮缺陷、隐窝萎缩、增生和发育异常（Dysplasia）的个体评分求和来计算组织学活性指数（n=7）
C. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲肠每组n=4，横结肠每组n=3，近端和远端结肠每组n=7）
D. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平
（2）炎症性肠病（IBD）诱导的增生/发育异常中DNA甲基化和DNA羟甲基化表征
图2：差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）富集的基因在与癌症发生和胃肠疾病相关的基因富集。
A. RRBS和oxRRBS技术示意图：通过比较RRBS和oxRRBS数据集分析5mC和5hmC水平。
B-C. 通过RRBS与oxRRBS结合鉴定1606个DMR（B）和3011个DhMR（C）的热图。
D-E. 通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受DMR（D）和DhMR（E）基因影响的功能和疾病。
B-C. 通过RRBS与oxRRBS结合鉴定1606个DMR（B）和3011个DhMR（C）的热图。
D-E. 通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受DMR（D）和DhMR（E）基因影响的功能和疾病。
（3）差异甲基化分析揭示IBD诱导的增生/发育异常中存在广泛的DMR和DhMR
图3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus诱导炎症在单核苷酸分辨率下的甲基化和羟甲基化动态变化
A. 784个低DMR，822个高DMR，1454个低DhMR和1557个高DhMR的基因组分布饼图
B. DMR/DhMR内每个CpG位点5mC和5hmC的动态变化。0.1是5mC/5hmC水平显著性变化的截止值。数字代表点数量。
B. DMR/DhMR内每个CpG位点5mC和5hmC的动态变化。0.1是5mC/5hmC水平显著性变化的截止值。数字代表点数量。
表1：H.hepaticus诱导的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎症CpG位点IPA差异甲基化和羟基甲基化的经典通路
（4）IBD诱导增生/发育异常中的基因表达变化
图4：炎症性肠病（IBD）和对照小鼠中近端结肠的转录组分析
A. 基于最高方差的500个基因的无监督分层聚类，显示对照组和IBD组之间明显分离
B. IPA鉴定上游调控因子Il10ra周围的网络
C. 使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受差异表达基因影响的疾病和功能
B. IPA鉴定上游调控因子Il10ra周围的网络
C. 使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受差异表达基因影响的疾病和功能
（5）DNA甲基化异常调控差异表达基因的综合分析
图5：IBD诱导的转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组变化之间的相关性
A-B. 差异表达且DMR（A）或DhMR（B）富集的基因散点图。颜色表示不同基因组表征，点大小表示每个区域的CpG数量。A. DNA表观遗传标记在IBD诱导的结直肠癌（CRC）发生中的作用的模型。
总结：
本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分别绘制了IBD诱导的DNA羟甲基化和DNA甲基化在全基因组中的变化。同时结合RNA-seq基因表达分析，研究结果首次全面揭示了结肠炎症诱导的表观遗传学变化，为进一步研究IBD生物标志物的发现提供了有用的信息，并有可能促进IBD新疗法的未来发展。
参考文献：
Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.
