数字恒温 CRISPR 技术-液滴微流控与恒温扩增的联合应用

CRISPR-Cas 系统自问世以来，从作为基因编辑的利器开始，发展至今已成为核酸检测的新型工具。特别是近年来，新型冠状病毒的快速检测需求增大。国内多位专家已发表过多篇应用 CRISPR-Cas 技术快速、灵敏地检测新冠病毒的文章。但目前基于 CRISPR 技术的检测仍以定性检测为主，定量检测仍有方法学上的难度。因此，在保证能定量研究的前提下确保检测方法的灵敏度、特异性和时效性是如今研究的下一个重点。

达普生物的联合创始人姚舒怀教授团队利用液滴微流控技术，在 CRISPR诊断领域合作取得新的进展。姚教授团队将 RPA 扩增与 Cas13a 检测融合为一步法 MEDICA（Microfluidics-Enabled Digital Isothermal Cas13a Assay），此方法不仅减少了 CRISPR 技术的检测时间，而且保证了检测方法的灵敏度、特异性，更是实现了对检测目标的绝对定量。该成果发表于分析化学领域的顶级期刊 Analytical Chemistry，影响因子 8.008。

香港科技大学姚舒怀团队发现，大多数 CRISPR 检测诊断平台通过检测荧光或条带，得到一个可视化、定性的结果。当需要相对定量的时候，需要 RPA 扩增及 Cas13a 检测两个步骤，并且使用荧光定量 PCR 通过一定的扩增循环与荧光检测来实现。这给工作流程带来更多的不确定性，且定量还会受到标准曲线的限制与影响。在本文中，姚教授将 RPA 反应与 Cas13a 检测通过微流控技术结合到一步法中（MEDICA），不仅提升了检测灵敏度，而且实现了稳定的绝对定量。
 

使用达普液滴微流控技术，将水相 1（检测模板、预混液）与水相 2（MgOAc）在需要反应时进行混合，混合后的水相与油相在微流控芯片中生成微液滴，再进行恒温反应。初始模板在分配进微液滴时符合泊松分布，因此可以根据泊松分布模型进行绝对定量的计算工作。
 

本文在试验优化及验证阶段，姚教授团队通过不同浓度及 pH 的 Tris-HCL、不同浓度的盐条件（NH₄(SO₄)₂, NaCl, KCl, CH₃COOK）及不同浓度的 PEG、Tween-20、引物探针等进行摸索试验，最终选定了一个最佳的优化条件。

在确定了反应最佳条件后，姚教授团队使用 HPV 16 质粒构建并且验证了一步法 RPA + Cas13a 于微流控体系中（数字恒温 CRISPR 方法）。上图可见，构建的数字恒温 CRISPR 方法灵敏度达到 1~5 copies/μL，稳定性也表现出色。

为了检验方法学在实际临床应用中的性能，姚教授团队使用质粒进行线性关系验证与临床样本进行验证，结果均展现较好的一致性。

姚教授团队构建的数字恒温 CRISPR 方法与临床使用 qPCR 方法检测 HPV16/HPV18 结果对比，阴阳性符合率达到 100%，并且将 CT 值与数字恒温 CRISPR 方法得到的绝对定量结果做相关性分析，R²＞0.95/0.93（HPV16/HPV18）。方法学产生差异的原因可能是 qPCR 标准品是由质粒代替，在低浓度下（CT 值 36 左右）与临床样本具有一定的差异性。另外，qPCR 会因为基因的偏好性，而展现出不同的扩增效率。由此可见，数字恒温 CRISPR 方法无需依赖标准品即可进行绝对定量，并且可以带来更快的检测速度和更灵敏的检测下限。

达普生物秉承为广大科研及临床工作者和企业客户提供世界领先技术平台的理念，聚团队研发力量结晶开发了基于微流控技术的全流程解决方案。