文献解读：微量样本甲基化测序在肿瘤中的应用

本期我们通过3篇高分文章来解读微量样本甲基化测序在肿瘤中的应用。
 
01 肝细胞癌诊断和预后
大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。本期我们通过3篇高分文章来解读微量样本甲基化测序在肿瘤中的应用。
 

标题：Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma（循环肿瘤DNA甲基化标志物在肝细胞癌诊断和预后中的价值）
期刊：Nature materials
2021影响因子: 43.841
发表时间：2017.11

摘要：
目前还没有一种有效的基于血液的方法来诊断和判断肝细胞癌(HCC)的预后。携带癌症特异性遗传和表观遗传突变的循环肿瘤DNA(ctDNA)可以实现非侵入性的“液体活检”，用于癌症的诊断和监测。在这里，作者通过比较肝癌组织和正常白细胞，确定了一组肝癌特异性甲基化标志物，并显示肝癌肿瘤DNA和匹配的血浆ctDNA的甲基化特征高度相关。利用来自1,098例肝癌患者和835例正常对照的cfDNA样本，作者构建了一个在诊断方面具有特异性和高度敏感性(P<0.001)的诊断预测模型，该模型与肿瘤负荷、治疗反应和分期高度相关。此外，作者还建立了预后预测模型，有效地预测了患者的预后和生存期(P<0.001)。这些发现共同证明了ctDNA甲基化标记物在肝癌的诊断、监测和预后中的作用。

队列：
为了研究肝细胞癌的ctDNA，作者采集了中国肝细胞癌患者和随机选择的健康对照者的血浆样本，得到了715名肝癌患者和560名正常健康对照的训练队列，以及383名肝癌患者和275名健康对照的验证队列。

结果：
ctDNA在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约20ng，并且混杂在更大量的正常游离DNA中，在这么微量的ctDNA中检测单个碱基的甲基化水平具有很大的挑战。

作者首先从全基因组水平上对肝癌组织和正常血液DNA的485，000个CpG位点甲基化水平进行了比较，筛选出差异性最显着的位点；设计相应的锁式探针(Padlock probe)，对近两千例肝癌和正常人血浆中提取的微量ctDNA进行了甲基化PCR扩增和测序（探针捕获靶向甲基化测序）；确定了这些位点的甲基化水平后，进而通过大量的统计学分析和计算，并利用多种人工智能模拟的机器学习方法，最后分别筛选出10个和8个位点建立了诊断模型和生存预后模型（图1)。
 

图1.数据生成和分析流程图

该诊断模型在训练队列715例肝癌患者和560例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了85.7%和94.3%（图2a），在验证队列383例肝癌患者和275例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了83.3%和90.5%（图2b）。作者还证明了这个模型可以将肝癌与正常对照区分开来(图2c、d)，此外，这10个标记物的无监督分级聚类能够以高度的特异性和敏感度将HCC与正常对照区分开来(图2e，f)。
   
此外，该模型还能准确的反映肝癌患者的TNM分期、体内有无肿瘤残留、对治疗的反应以及有无复发等（图3）。
   
而对1049例生存资料完整的肝癌患者，依据生存预后模型进行评分，低风险组患者的预后显着优于高风险组患者（图4），显示出利用该模型可以准确预测肝癌患者的预后，有利于对不同的风险的患者进行更为个体化的治疗。
   
02 肿瘤溯源

标题：Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.（甲基化单倍型鉴定有助于异质组织样本的去卷积以及根据血浆DNA的对肿瘤溯源）

期刊：Nature genetics

2021影响因子: 38.33

发表时间：2017.4

摘要：
哺乳动物基因组中相邻的CpG位点可以由于甲基转移酶或去甲基酶的加工性而共享相似的甲基化状态，而DNA甲基化是细胞类型特异性的，并且该模式可以用于分析异源样品的相对细胞组成，因此共甲基化的CpG可以作为一组基因组特征用于标记组织的来源。作者对人体全基因组中表现出高度一致得甲基化区域进行系统性调查，使用61组全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)数据定义了147,888个紧密耦合的CpG位点，称为甲基化单倍型(MHBs)，并用101组简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)数据和637组甲基化芯片数据进一步验证了这一点。还使用一种称为甲基化单倍型负荷(MHL)的指标，作者在区块（blocks）水平上进行了组织特异性甲基化分析。最后，作者使用甲基化单倍型对59例癌症患者的无细胞循环DNA中的肿瘤负荷和组织起源进行了定量估计。

方法：
作者首先通过61 组WGBS数据发现了MHB(甲基化单倍型区块)，接着利用101 组RRBS数据和637组甲基化芯片数据对MHB进行验证。建立甲基化单倍型负荷（MHL）模型，进行组织特异性MHB分析，最后使用29个WGBS数据和14个RRBS数据以及59个RRBS数据（癌症患者血清）；10个RRBS数据（和血清配对的肿瘤组织）；75个RRBS数据（对照血清）对模型进行训练和测试（图1）。
 

结果：
由61组WGBS数据建立的MHBs代表了一种独特的基因组特征，它与多个已知的基因组元件部分重叠(图2)。在所有MHBs中，60828个(41.1%)位于基因间隔区，87060个(58.9%)位于转录区。这些MHBs在增强子、超级增强子、启动子、CpG岛和印记基因上显著富集(P<1.0×10−6)。
   
 
为了能够对许多样本中单个MHBs中的甲基化模式进行定量分析，作者需要一个单一的度量来定义每个区块中多个CpG位点的甲基化模式。理想情况下，这一指标不仅是区块中所有CpG位点的平均甲基化水平的函数，而且还可以捕捉单个DNA分子上的共甲基化模式。因此，作者定义了甲基化单倍型负荷(MHL)，对比其他定量方法，NHL表现出更好的MHB区分能力（图3）。
   
作者发现组织特异性MHL在癌症患者血浆中存在，但在正常血浆或全血中无法检测到，因此组织特异性MHL在相应的组织和癌症血浆中可见，这表明组织起源标测的可行性（图4a）。接着，作者在基于10个人类正常组织的WGBS和RRBS数据集中，筛选出具有组织特异性的MHB（图4b），将预测模型应用于来自癌症患者和正常个体的血浆样品,预测准确性平均达到82.8%, 88.5%, 91.2%（分别是CCP,LCP和NCP样本）（图4c）。  
这项研究表明，血浆中的ctDNA甲基化单倍型分型可能是是一种用于早期检测肿瘤及其主要生长部位，以及连续监测肿瘤进展和多器官转移的有效指标。
 

03 泛癌种诊断和预后

标题：DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers（DNA甲基化标志物在常见癌症诊断和预后中的应用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影响因子: 11.205

发表时间：2017.5

摘要：
使用微创活检识别特定癌症对于改善癌症的诊断、治疗选择和预后预测有着很大的帮助。利用来自癌症基因组图谱(TCGA)的全基因组甲基化数据和机器学习方法，作者评估了DNA甲基化在区分四种常见癌症(乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌)肿瘤组织和正常组织中的有效性。作者在1,619个肿瘤样本和173个邻近正常组织样本的训练队列中确定了癌症标记物。作者的发现在一个单独的TCGA队列中得到了验证，DNA甲基化分析可以预测癌症和正常组织，准确率超过95%，同时也准确地将30个转移到肝脏的结直肠癌中的29个和34个转移到肺的结直肠癌中的32个确定下来。作者发现这种检测方法还可以预测患者的预后和存活率。综上所述，这些发现证明了甲基化生物标记物对描述癌症分子特征的作用，并对诊断和预后有一定的意义。

结果：
与不同癌症类型的甲基化情况相关的无监督等级聚类和热图显示，甲基化图谱能够识别癌症特异性甲基化特征。ROC曲线表明，对不同肿瘤类型的预测具有较高的敏感性和特异性，因此甲基化特征可以区分不同的癌症类型和相应的正常组织（图1）。
 

 
由于识别起源组织对于肿瘤转移患者选择最佳的治疗策略是至关重要的，因此除了原发肿瘤外，作者还分析了30例结直肠癌肝转移和34例结直肠癌肺转移病例。研究发现，无监督分级聚类可以将这些转移与结肠癌或正常组织区分开来(图2)。
   
接下来，作者评估了甲基化标记对每种癌症的预后效果。该模型在Kaplan-Meier分析中区分低风险组和高风险组以及具有显著P值的相关对数等级检验中表现良好，表明甲基化标签在一定程度上可以预测BRCA和LUAD的预后。

鉴于DNA甲基化是基因表达的重要表观遗传调节因子，作者研究了癌症和正常组织中基因位点的差异甲基化是如何与基因表达相关的。作者观察到启动子甲基化和基因表达之间的负相关，并确定了几个已知在癌症发生中起重要作用的基因，以及在LIHC中功能相对未知的基因。在表达降低的高甲基化基因中，作者选择了一个LIHC的相关基因FUZ，FUZ的过表达抑制了LIHC细胞系的生长(图3)，这说明癌症甲基化特征与其基因表达模式和功能相关。  
作者认为，DNA甲基化可以通过更准确的诊断来帮助患者改善预后，特别是相对惰性或者侵袭性肿瘤。虽然在本文中只选取了4种常见癌症，但是作者认为，DNA甲基化检测可以应用于更多不同种类的癌症诊疗中，其最大的优势在于只需要少量的组织获得足够的DNA就可以完成检测。
 
参考文献：
https://www.nature.com/articles/nmat4997
https://www.nature.com/articles/ng.3805
https://www.pnas.org/content/114/28/7414