脂肪间充质干细胞ADSCs的介绍与其分离培养的详细步骤

在普遍的认知中，大多数人会把脂肪当作身体中一种不受欢迎的物质，甚至与“肥胖”划等号。随着物质生活水平的提高，人体内摄入的卡路里越来越多，也就容易造成了肥胖。肥胖不仅影响形体的美观，而且容易引发人体诸多疾病，世界卫生组织（WHO）已将肥胖定义为慢性疾病。

其实，我们不必“谈脂色变”，适量的脂肪是人体不可或缺的营养元素之一，除了为人体提供热量，它还承担着保护内脏、影响内分泌、抵御寒冷等多种功能。你或许还不知道，脂肪组织中还蕴藏着神秘又宝藏的黄金资源——脂肪间充质干细胞，今天就带你重新认识她。
 

ADSCs是什么？

脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs），与其他种类的干细胞家族成员一样具有强大的自我复制和多向分化潜能。作为一种成体干细胞，试想每个哺乳动物身上都拥有脂肪组织，而且脂肪组织来源的脂肪间充质干细胞密度是骨髓中骨髓间充质干细胞的500倍。那这个干细胞来源是不是很容易获取、很丰富呢？另外，较其他种类间充质干细胞，脂肪间充质干细胞具有更强的旁分泌作用，在医美美容相关的填充和修复应用中发挥了积极作用。
 

脂肪组织结构及其衍生物

ADSCs分离培养

了解了脂肪间充质干细胞的故事，接下来我们一起来学习成人脂肪间充质干细胞分离提取、传代培养的全过程。

材料准备
样本：健康成人的脂肪组织≥10mL, 采集时间≤48h，运输保存温度4℃。

试剂：OriCell^®PBS 100mL、OriCell^®成人脂肪间充质干细胞完全培养基50mL、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型胶原蛋白酶。

耗材：50mL无菌采集瓶一个、50mL离心管5-10个、10mL移液管4个、T75培养瓶若干个、T175培养瓶若干个、100μm细胞滤网1个。

脂肪清洗及胶原酶消化

1.1 生物安全柜内打开脂肪采集瓶，将采集瓶内的脂肪转移至T175培养瓶中，加入OriCell^®PBS。脂肪和OriCell^®PBS的体积比为1:2，拧紧盖子，剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5min，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作，直至下层液较为清澈。

1.2 向T175培养瓶中加入体积比为1:2的新配制（提前半小时预热）的125U/mL的OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型胶原蛋白酶溶液，封口膜封口，剧烈晃动离心管5~10秒，置于水浴振荡器中，37℃，150rpm消化30min。

分离基质血管组分（SVF）
1.3 将消化后的组织液，室温900×g，离心10min，得到的沉淀即为SVF（Stromal Vascular Fraction）。

1.4 用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。

洗涤基质血管组分（SVF）
1.5 SVF沉淀中加适量OriCell^®PBS重悬细胞，吹散。室温300×g，10min离心。

1.6 离心完后，小心吸去上清液。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油脂。

1.7 再向SVF沉淀中加入40mL的OriCell^®PBS重悬细胞。

1.8 100μm细胞滤网过滤细胞悬液到新的50mL的离心管中，去除未消化的纤维组织和其他杂质。

1.9 过滤后的细胞悬液吹匀，室温250×g，6min离心。

原代接种
2.0 离心后，用移液管吸取并去掉上清液。

2.1 用OriCell^®成人脂肪间充质干细胞完全培养基重悬离心管中的细胞，接种T75培养瓶中，补足培养基到10mL/瓶。

2.2 将培养瓶放入培养箱中37℃，5%CO₂条件培养。

换液操作
2.3 原代接种第二天进行第一次半量换液。

2.4 轻轻将培养瓶中的培养基倒入50mL离心管中，500×g，6min离心。

2.5 T75培养瓶中加入离心完毕的5mL旧培养基，5mL新OriCell^®成人脂肪间充质干细胞完全培养基，半量换液完毕。

2.6 将培养瓶放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

2.7 完成第一次换液后，每隔3天进行一次半量换液(可以根据生长情况适当调整)。

传代培养
（P0传P1与P1后传代的操作方法流程一致）
2.8 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

2.9 吸去培养容器中的培养基。用OriCell^®PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤细胞2次，注意动作轻柔，清洗全面。吸去PBS。

3.0 加入胰酶(T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL)，迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。

3.1 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。立即加入完全培养基(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)，随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

3.2 使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。

注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。

3.3. 将细胞悬液转移至离心管中。用OriCell^®PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤容器1次，收集残留细胞。

3.4. 收集的所有细胞悬液以250×g，离心4min。

3.5. 离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。将细胞按(2.5~4)×10⁴个活细胞/cm² 接种至适宜的培养容器内。

注意：培养脂肪间充质干细胞对于细胞密度有较高的要求，我们建议有条件且计数效率较高的情况下，进行手工计数，以期获得精准的细胞浓度指导接种;在没有精确计数条件的情况下，按照适宜比例传代是更好的方法。通常脂肪间充质干细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。

3.6. 摇匀细胞，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

3.7. 传代次日，观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞，应予以换液。待细胞生长至90%汇合，即需传代或冻存。