细胞复苏失败原因分析——复苏篇

细胞复苏成败和冻存及复苏操作密切相关。上个星期和大家分享了细胞冻存方面容易出错的细节，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇主要从复苏角度分析，排查复苏过程中容易出现的问题。


复苏步骤

同样，我们先复习一下复苏步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温，离心机设置好转速；

2. 准备一个15ml离心管并加入适量培养基。

3. 取出冻存管，浸入水浴锅迅速摇晃使细胞在2min内充分融化；

4. 将细胞悬液缓慢滴入提前加了培养基的离心管，1000rpm 3min离心；

5. 弃上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，放入培养箱。


复苏常见的错误操作

1. 若液氮或冰箱距离水浴锅较远，没有做保冷措施

为防止细胞在运输路上开始融化（特别是夏季），冻存细胞需要放在干冰或冰盒上运送至水浴锅。


2. 运输冻存管时手触碰到细胞部分或放在了口袋里

请勿用手触碰冻存管身，避免局部温度升高导致细胞开始融化。应捏住管盖或放在容器中运输


3. 采用错误的方式融化细胞

不要用手捂化（搓热也不行），手心温度不够高，细胞受热不均匀且降温速度太慢导致细胞死亡。


4. 水浴时没有严格控制时间，直接放水里静置，没有晃动促进融化

细胞复苏需遵循“快融”原则，建议在2min内将细胞充分融化，水浴时间越长活率越低。最好的方法是捏住管盖，将管身浸没水中快速摇晃，促进细胞融化。切忌将冻存管静置在水浴中。


5. 水浴结束时管内还有较大冰块

如果没融化完全，还有比较大的冰块，也会导致细胞死亡。一方面冰块中的细胞缓慢升温而死亡，另一方面冰块导致已融化的细胞被低温损伤。

有的同学说2min的水浴很难让细胞融化，那么咱们可以将水浴锅温度提高至39度（小编亲测可行），摇晃速度加快，担心污染可以将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴。水浴锅里的水不能太少，否则冻存管放入水后局部温度会达不到预设温度，导致融化过慢。


6. 细胞融化后没有离心去除DMSO

有的同学复苏细胞会在细胞融化后加10倍培养基稀释，不离心直接培养，等细胞贴壁后换液。虽然这对于好养的贴壁细胞是可行的，但不是长远之计，也不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞有一定毒性，有些细胞对DMSO比较敏感，如HL-60细胞等。如果你不清楚自己的细胞是否对DMSO敏感，那么还是离心去除上清最为保险。


以上由小尚多年经验总结而来，结合冻存篇，基本可以解决所有复苏失败的问题。如果还有没提及的知识点，欢迎同学们可以在评论区补充~