DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路分享

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总体来说，DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
 
一、甲基化图谱分析
（1）平均甲基化水平的比较

• 平均甲基化水平能反应样本整体的甲基化水平。
• 但是平均水平差异不大并不能说明样本间甲基化图谱没有差异。

（2）CG/CHG/CHH甲基化水平分布

• 不同物种中，甲基化修饰可能倾向于发生在不同类型的C位点上，该分析有助于反应甲基化发生位点类型的偏好性。
• 甲基化水平分布的组间比较，能够更进一步了解组间甲基化水平的变化。
• 不同基因组元件（CGI相关元件、重复序列元件、基因元件等）的甲基化水平分布规律不同。特别是在不同物种中，基因元件的甲基化水平可能有一定的特点。
• 比较特定元件甲基化水平的组间差异也能发现潜在的功能差异。

（3）降维分析
降维分析尝试找到最能反映数据点真实分布情况的两个维度，以方便对数据进行直观把握。一般采用共同覆盖的5×以上位点进行分析：

• 主成分分析（PCA）
• 非度量多维标度法（NMDS）
• 主坐标分析（PCoA）

PCA可采用统计检验分析组间差异的显著性：
ü  相似性分析（ANOSIM）
ü  置换多元方差分析（ADONIS）
 

（4）聚类分析

• 聚类分析考虑的是各样本之间的距离，即不相似性。一般采用共同覆盖的5×以上位点进行分析。
• 与降维分析的差别在于，聚类分析更真实地反映样本的差距，而非仅考虑两个代表性维度。

• 相关性分析考虑的是各样本之间的相似性。一般采用共同覆盖的5×以上位点进行分析。
• 一般采用皮尔森相关系数

  （1）DMC/DMR鉴定

• 差异甲基化位点：DMC
• 差异甲基化区域：DMR

（甲基化位点一般是与附近的位点一起起作用的）
ü  鉴定实验组与对照组甲基化图谱的具体差异。
ü  如果实验设计包括多个时间节点，也可以比较相邻时间节点/感兴趣的时间节点之间的甲基化图谱的差异。
（2）DMC/DMR转录因子结合分析（TF binding motif ）
主要关注Promoter和Enhancer等调控区域DMC/DMR的TF结合位点。 3）时序甲基化数据的分析策略（Time Course）
l  比较相邻时间点的差异
l  直接筛选时间阶段相关的DMC和DMR
ü  线性模型/混合线性模型
  （可以排除混杂因素干扰，如性别）
l  共甲基化模式分析(阶段特异性Cluster筛选)
ü  WGCNA（权重基因共表达网络分析）
ü  MEGENA（多尺度嵌入式基因共表达网络分析）
ü  mfuzz
ü  ... ...
 

• TE（转座元件）：影响基因组稳定性        
• Promoter：影响基因表达
• Genebody

（5）差异甲基化基因集（DMGs)的功能分析
分析策略：

• 可以分为Hyper-DMG和Hypo-DMG
• 可以分为Promoter-DMG和Genebody-DMG
• Gene Ontology
• KEGG pathway
• Reactome pathway
• DisGeNET disease
• Disease Ontology

三、组学关联分析：甲基化组学&转录组学
（1）Meta genes整体关联

• 同一样本/组别内，所有基因的表达水平与对应基因的甲基化水平进行关联。
• 研究的是基因甲基化与表达的整体关系。

TSS位点附近负相关
Genebody区正相关 整体负相关

（2）DMG-DEG对应关联

• 重叠分析：

特点：简单粗暴，也适用于样本量少的情况。
分析结果：韦恩图。

• 皮尔森/斯皮尔曼相关性分析

特点：准确计算相关性程度（R值），及其显著性（p值）。
分析结果：散点图（+拟合线）；相关性热图
 
（3）网络关联
基于基因表达具有功能和通路的富集性。有最低样本数量要求。

• 共表达-共甲基化网络关联：

ü  WGCNA module correlation
ü  EMDN algorithm

• 融合网络关联：

ü  SNF algorithm
以上就是关于DNA甲基化测序的数据挖掘思路分享。