染色质免疫共沉淀ChIP实验的详细实验步骤
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。
开始 ChIP 之前要考虑三件事
（1）为您的实验查找适合的抗体
（2）优化染色质剪切
（3）评估您的 ChIP 实验能否成功
五个步骤获得理想 ChIP 结果
Step1：交联和裂解——稳定复合物并分离核组分
第一步对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析。通常采用甲醛交联，加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。
接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。
注意：此时可以停止ChIP测定。 经过交联，淬灭和洗涤细胞沉淀后，将裂解物于-80℃储存。
Step2：染色质片段化——DNA片段化
细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是最难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。
注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。
Step3：免疫沉淀——捕获并分离蛋白质-DNA复合物
使用抗体捕获蛋白质-DNA复合物中的目标蛋白质是实验成功的关键因素。抗体免疫沉淀并从细胞核组分中分离蛋白质，去除不相关的细胞物质。
使用抗体结合磁珠完成所得抗体-蛋白质-DNA复合物的纯化。经过孵育后，充分洗涤磁珠-抗体-蛋白质-DNA复合物，纯化并洗脱蛋白质-DNA复合物。
Step4：制备DNA——解交联和DNA纯化
现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。
注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。
Step5：定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平
在该步骤中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定位点。
参考文献：
开始 ChIP 之前要考虑三件事
（1）为您的实验查找适合的抗体
（2）优化染色质剪切
（3）评估您的 ChIP 实验能否成功
五个步骤获得理想 ChIP 结果
Step1：交联和裂解——稳定复合物并分离核组分
第一步对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析。通常采用甲醛交联，加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。
接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。
注意：此时可以停止ChIP测定。 经过交联，淬灭和洗涤细胞沉淀后，将裂解物于-80℃储存。
Step2：染色质片段化——DNA片段化
细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是最难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。
注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。
Step3：免疫沉淀——捕获并分离蛋白质-DNA复合物
使用抗体捕获蛋白质-DNA复合物中的目标蛋白质是实验成功的关键因素。抗体免疫沉淀并从细胞核组分中分离蛋白质，去除不相关的细胞物质。
使用抗体结合磁珠完成所得抗体-蛋白质-DNA复合物的纯化。经过孵育后，充分洗涤磁珠-抗体-蛋白质-DNA复合物，纯化并洗脱蛋白质-DNA复合物。
Step4：制备DNA——解交联和DNA纯化
现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。
注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。
Step5：定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平
在该步骤中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定位点。
参考文献：
- thermofisher
- doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z
