L-929（NCTCclone929）小鼠成纤维细胞的培养步骤及应用
一、细胞简介：
细胞名称：L-929（NCTCclone929）小鼠成纤维细胞
平台编号:zl-056197
1948年三月建立了NCTCclone929(小鼠结缔组织)，细胞系L的克隆。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，而clone929是最早的克隆株。从一只100日龄的雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松结缔组织入脂肪组织中建立了亲本细胞系L。第95代的细胞系L使用毛细管法分离单细胞建立了clone929。检测发现鼠痘病毒阴性。
细胞特性
1）来源：组织：皮下结缔组织；疏松结缔组织及脂肪品系：C3H/An
2）形态：成纤维细胞，贴壁生长
3）含量：>1x106细胞数
4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
5)用途：仅供科研使用。
二．细胞的培养：
1）准备MEM培养基；马血清10%；双抗，1%。该细胞不能用胎牛血清培养。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%马血清或完全培养基，10%DMSO，现用现配。
三．细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
四、运输和保存
干冰运输及复苏好存活细胞
（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
五、细胞接收后的处理
1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系质粒载体网。
2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。
3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。
六、应用
用于羊栖菜多酚分离纯化及对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤影响研究
运用Folin-Ciocalteu比色法对羊栖菜多酚含量进行测定,并对该方法进行了优化;然后利用酶辅助提取法对羊栖菜多酚进行提取,并对提取条件进行了优化;采用大孔吸附树脂法对羊栖菜多酚进行分离纯化,并对纯化条件进行了优化以获得高纯度的羊栖菜多酚,另外测定了其体外抗氧化能力。
通过羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的保护作用、修复作用及细胞内有关抗氧化酶的变化,研究了羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响,为羊栖菜多酚在抗紫外损伤方面的应用提供了一定的理论依据和数据支持。
为了明确羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响,研究了UV辐射剂量、羊栖菜多酚浓度及时间对细胞生长的影响,结果表明UV辐射剂量越大,小鼠成纤维细胞受到抑制越严重,UV辐射剂量为0.15J/cm2时最接近半致死剂量,作为后续实验的UV照射剂量;羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞的保护作用随多酚浓度的增大呈现先增强后减弱的趋势,在羊栖菜多酚浓度为90μg/mL时保护作用最强。
从时间上看,加入羊栖菜多酚后培养4h再进行UV照射,保护作用最明显,随着时间的延长,保护作用开始下降。羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的修复作用,同样随着羊栖菜多酚浓度的增大呈先增强后减弱的趋势,在80μg/mL浓度时修复作用达到最强。此外,羊栖菜多酚能增强UV照射的小鼠成纤维细胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,并降低丙二醛的含量。
细胞名称：L-929（NCTCclone929）小鼠成纤维细胞
平台编号:zl-056197
1948年三月建立了NCTCclone929(小鼠结缔组织)，细胞系L的克隆。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，而clone929是最早的克隆株。从一只100日龄的雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松结缔组织入脂肪组织中建立了亲本细胞系L。第95代的细胞系L使用毛细管法分离单细胞建立了clone929。检测发现鼠痘病毒阴性。
细胞特性
1）来源：组织：皮下结缔组织；疏松结缔组织及脂肪品系：C3H/An
2）形态：成纤维细胞，贴壁生长
3）含量：>1x106细胞数
4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
5)用途：仅供科研使用。
二．细胞的培养：
1）准备MEM培养基；马血清10%；双抗，1%。该细胞不能用胎牛血清培养。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%马血清或完全培养基，10%DMSO，现用现配。
三．细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
四、运输和保存
干冰运输及复苏好存活细胞
（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
五、细胞接收后的处理
1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系质粒载体网。
2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。
3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。
六、应用
用于羊栖菜多酚分离纯化及对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤影响研究
运用Folin-Ciocalteu比色法对羊栖菜多酚含量进行测定,并对该方法进行了优化;然后利用酶辅助提取法对羊栖菜多酚进行提取,并对提取条件进行了优化;采用大孔吸附树脂法对羊栖菜多酚进行分离纯化,并对纯化条件进行了优化以获得高纯度的羊栖菜多酚,另外测定了其体外抗氧化能力。
通过羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的保护作用、修复作用及细胞内有关抗氧化酶的变化,研究了羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响,为羊栖菜多酚在抗紫外损伤方面的应用提供了一定的理论依据和数据支持。
为了明确羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞抗紫外损伤的影响,研究了UV辐射剂量、羊栖菜多酚浓度及时间对细胞生长的影响,结果表明UV辐射剂量越大,小鼠成纤维细胞受到抑制越严重,UV辐射剂量为0.15J/cm2时最接近半致死剂量,作为后续实验的UV照射剂量;羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞的保护作用随多酚浓度的增大呈现先增强后减弱的趋势,在羊栖菜多酚浓度为90μg/mL时保护作用最强。
从时间上看,加入羊栖菜多酚后培养4h再进行UV照射,保护作用最明显,随着时间的延长,保护作用开始下降。羊栖菜多酚对UV照射的小鼠成纤维细胞的修复作用,同样随着羊栖菜多酚浓度的增大呈先增强后减弱的趋势,在80μg/mL浓度时修复作用达到最强。此外,羊栖菜多酚能增强UV照射的小鼠成纤维细胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,并降低丙二醛的含量。
