TC-1小鼠肺上皮细胞的培养方法及应用
一、细胞简介：
细胞名称：TC-1小鼠肺上皮细胞
平台编号:zl-056881
二．细胞的培养
1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
三、细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
四、应用
用于熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬性死亡中线粒体相关机制的探讨研究
探讨线粒体在熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬相关性死亡中的作用。
方法：利用细胞培养技术，熊果酸实验浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM，作用TC-1细胞24小时后，普通光镜下观察细胞数目及形态的变化；各种浓度熊果酸分别作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法检测熊果酸对TC-1癌细胞增殖抑制作用；
利用流式细胞术检测线粒体膜跨电位及细胞内ATP和ROS水平变化；分光光度法检测线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1细胞6小时后，在透射电镜下检测线粒体形态变化；荧光显微镜下观察线粒体与自噬标志蛋白LC3的位置关系。
结果光镜下可见熊果酸作用24小时，10μM浓度组的细胞形态没有明显改变，而20μM或30μM组的细胞变圆，贴壁松散，分布稀疏，及细胞两极出现黑色小点，出现不同程度的细胞死亡；
MTT实验结果显示熊果酸对TC-1癌细胞有显著的增值抑制作用，并呈时间、剂量依赖，尤其是作用3天后，各组抑制率均达90%以上（P＜0．05）；当熊果酸作用24小时，阴性象限荧光占总荧光的比例分别为3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，阴性象限比例越大线粒体膜跨电位（Δψm）越低，表明Δψm随着熊果酸作用浓度升高而降低，UA30μM组Δψm降低尤其显著（P＜0．05）；
线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV的活性经熊果酸作用24小时均出现明显抑制，尤其是复合酶IV（P＜0．05）；经熊果酸作用24小时，10μM组即出现细胞内ATP水平显著降低；
熊果酸30μM分别作用0、4、8、12、24小时，细胞内ATP水平随作用时间延长逐渐降低，呈时间依赖，并且作用4小时，与对照比ATP水平降低超过50%，12小时后，ATP水平接近0nmol/mg/protein（P＜0．05）；细胞内ROS的水平也随熊果酸作用浓度升高而显著降低，熊果酸作用24小时细胞内ROS阳性率分别是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05）。
细胞名称：TC-1小鼠肺上皮细胞
平台编号:zl-056881
二．细胞的培养
1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
三、细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
四、应用
用于熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬性死亡中线粒体相关机制的探讨研究
探讨线粒体在熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬相关性死亡中的作用。
方法：利用细胞培养技术，熊果酸实验浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM，作用TC-1细胞24小时后，普通光镜下观察细胞数目及形态的变化；各种浓度熊果酸分别作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法检测熊果酸对TC-1癌细胞增殖抑制作用；
利用流式细胞术检测线粒体膜跨电位及细胞内ATP和ROS水平变化；分光光度法检测线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1细胞6小时后，在透射电镜下检测线粒体形态变化；荧光显微镜下观察线粒体与自噬标志蛋白LC3的位置关系。
结果光镜下可见熊果酸作用24小时，10μM浓度组的细胞形态没有明显改变，而20μM或30μM组的细胞变圆，贴壁松散，分布稀疏，及细胞两极出现黑色小点，出现不同程度的细胞死亡；
MTT实验结果显示熊果酸对TC-1癌细胞有显著的增值抑制作用，并呈时间、剂量依赖，尤其是作用3天后，各组抑制率均达90%以上（P＜0．05）；当熊果酸作用24小时，阴性象限荧光占总荧光的比例分别为3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，阴性象限比例越大线粒体膜跨电位（Δψm）越低，表明Δψm随着熊果酸作用浓度升高而降低，UA30μM组Δψm降低尤其显著（P＜0．05）；
线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV的活性经熊果酸作用24小时均出现明显抑制，尤其是复合酶IV（P＜0．05）；经熊果酸作用24小时，10μM组即出现细胞内ATP水平显著降低；
熊果酸30μM分别作用0、4、8、12、24小时，细胞内ATP水平随作用时间延长逐渐降低，呈时间依赖，并且作用4小时，与对照比ATP水平降低超过50%，12小时后，ATP水平接近0nmol/mg/protein（P＜0．05）；细胞内ROS的水平也随熊果酸作用浓度升高而显著降低，熊果酸作用24小时细胞内ROS阳性率分别是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05）。
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