人内脏脂肪细胞的应用及复苏操作要点
一、背景
人内脏脂肪细胞是从脏器脂肪中分离而来。内脏脂肪是人体脂肪中的一种，与皮下脂肪不同，它围绕着人的脏器，主要存在于腹腔内，对人的内脏起着支撑、稳定和保护的作用。与皮下脂肪库累积导致的外周型肥胖相比，内脏脂肪过度沉积与糖尿病、冠心病等一些肥胖相关性疾病的发生发展密切相关，因此，研究内脏脂肪细胞的调节机制对于肥胖及其相关疾病的防治具有重要意义。
二、复苏操作要点
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
三、应用
用于Sirt1对内脏脂肪细胞定向分化的影响及机制研究：
组蛋白去乙酰化酶Sirtuin-1（Sirtl）基因不仅可抑制皮下白色脂肪分化而抑制肥胖,Sirt1过表达还可促进PPAR-γ去乙酰化,招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“米色化”而引起显著的产热效应。但有趣的是,Sirt1转基因小鼠内脏脂肪中并没有出现明显的米色脂肪,提示Sirt1对皮下与内脏脂肪的分化调控存在差别。基于临床研究提示Sirt1的表达水平与内脏脂肪沉积密切相关,本研究拟从细胞及动物实验多层面并结合Sirt1过表达及激动剂的应用,探讨Sirt1对内脏脂肪前体分化的调控作用以及新型Sirt1激动剂BTM-0512对高脂诱导实验性肥胖的抑制效果及机制。
方法临床研究：按照一定的纳入标准及排除标准收集腹部手术患者内脏脂肪组织,以BMI≥25.0个体为超重/肥胖组,以BMI在18.5-24.9之间个体为对照组；免疫组织化学检测脂肪组织中Sirt1、PRDM16蛋白表达；Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16表达水平。细胞实验：选取临床研究中对照组患者内脏脂肪组织进行SVF原代细胞培养,通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记。构建Human-Sirtl过表达慢病毒载体。
实验分组为：①对照组,转染慢病毒包装的空质粒；Sirt1过表达组,转染慢病毒包装的Sirt1过表达质粒。提取细胞总RNA,Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin的mRNA表达水平；油红O染色检测细胞脂质沉积。动物实验：高脂饮食连续饲养C57BL/6J小鼠8周建立肥胖模型。造模后分别给予两种Sirtl激动剂白藜芦醇及其甲基化衍生物BTM-0512进行治疗性给药,实验分为对照组,模型组,BTM-0512低剂量组（5mg/kg）,BTM-0512中剂量组（10mg/kg）,BTM-0512高剂量组（20mg/kg）,白藜芦醇组（10mg/kg）。连续给药时间分别为2、4、6周,分别检测体重、体长、内脏脂肪湿重。然后选择给药4周小鼠,测血糖、血脂,并分别取内脏及肩胛间脂肪,提取总RNA,Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin、TMEM26的mRNA表达水平。
结果：（1）在临床研究中,与对照组相比,肥胖人群内脏脂肪组织中Sirt1与总PRDM16蛋白及mRNA表达下降,而全长PRDM16mRNA表达无明显差异。
（2）在细胞实验中,与对照组相比,Sirt1基因过表达组脂质沉积明显降低,同时,Resistin、UCP1、C/EBPβ、全长PRDM16mRNA表达水平明显降低,总PRDM16表达两组间无明显差异。
（3）在动物实验中,与对照组相比,模型组血糖、血脂、体重、Lee’s指数、内脏脂肪指数明显升高；BTM-0512及白藜芦醇明显降低小鼠血糖、血脂、体重、Lee’s指数、内脏脂肪指数,且BTM-0512较白藜芦醇作用更加明显。
（4）在动物实验中,与模型组相比,BTM-0512组和白藜芦醇组小鼠内脏脂肪中Sirt1、总PRDM16mRNA表达上调,而全长PRDM16、UCP1、C/EBPβ、TMEM26、Resistin表达则显著下调。
（5）在动物实验中,与模型组相比,BTM0512和白藜芦醇组小鼠棕色脂肪中Sirt1、UCP1、全长PRDM16与总PRDM16的表达皆升高,Resistin、C/EBPβ、TMEM26表达无明显差异。
四、注意事项
1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。
3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。
4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
人内脏脂肪细胞是从脏器脂肪中分离而来。内脏脂肪是人体脂肪中的一种，与皮下脂肪不同，它围绕着人的脏器，主要存在于腹腔内，对人的内脏起着支撑、稳定和保护的作用。与皮下脂肪库累积导致的外周型肥胖相比，内脏脂肪过度沉积与糖尿病、冠心病等一些肥胖相关性疾病的发生发展密切相关，因此，研究内脏脂肪细胞的调节机制对于肥胖及其相关疾病的防治具有重要意义。
二、复苏操作要点
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
三、应用
用于Sirt1对内脏脂肪细胞定向分化的影响及机制研究：
组蛋白去乙酰化酶Sirtuin-1（Sirtl）基因不仅可抑制皮下白色脂肪分化而抑制肥胖,Sirt1过表达还可促进PPAR-γ去乙酰化,招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“米色化”而引起显著的产热效应。但有趣的是,Sirt1转基因小鼠内脏脂肪中并没有出现明显的米色脂肪,提示Sirt1对皮下与内脏脂肪的分化调控存在差别。基于临床研究提示Sirt1的表达水平与内脏脂肪沉积密切相关,本研究拟从细胞及动物实验多层面并结合Sirt1过表达及激动剂的应用,探讨Sirt1对内脏脂肪前体分化的调控作用以及新型Sirt1激动剂BTM-0512对高脂诱导实验性肥胖的抑制效果及机制。
方法临床研究：按照一定的纳入标准及排除标准收集腹部手术患者内脏脂肪组织,以BMI≥25.0个体为超重/肥胖组,以BMI在18.5-24.9之间个体为对照组；免疫组织化学检测脂肪组织中Sirt1、PRDM16蛋白表达；Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16表达水平。细胞实验：选取临床研究中对照组患者内脏脂肪组织进行SVF原代细胞培养,通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记。构建Human-Sirtl过表达慢病毒载体。
实验分组为：①对照组,转染慢病毒包装的空质粒；Sirt1过表达组,转染慢病毒包装的Sirt1过表达质粒。提取细胞总RNA,Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin的mRNA表达水平；油红O染色检测细胞脂质沉积。动物实验：高脂饮食连续饲养C57BL/6J小鼠8周建立肥胖模型。造模后分别给予两种Sirtl激动剂白藜芦醇及其甲基化衍生物BTM-0512进行治疗性给药,实验分为对照组,模型组,BTM-0512低剂量组（5mg/kg）,BTM-0512中剂量组（10mg/kg）,BTM-0512高剂量组（20mg/kg）,白藜芦醇组（10mg/kg）。连续给药时间分别为2、4、6周,分别检测体重、体长、内脏脂肪湿重。然后选择给药4周小鼠,测血糖、血脂,并分别取内脏及肩胛间脂肪,提取总RNA,Real-timePCR检测Sirt1、全长PRDM16、总PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin、TMEM26的mRNA表达水平。
结果：（1）在临床研究中,与对照组相比,肥胖人群内脏脂肪组织中Sirt1与总PRDM16蛋白及mRNA表达下降,而全长PRDM16mRNA表达无明显差异。
（2）在细胞实验中,与对照组相比,Sirt1基因过表达组脂质沉积明显降低,同时,Resistin、UCP1、C/EBPβ、全长PRDM16mRNA表达水平明显降低,总PRDM16表达两组间无明显差异。
（3）在动物实验中,与对照组相比,模型组血糖、血脂、体重、Lee’s指数、内脏脂肪指数明显升高；BTM-0512及白藜芦醇明显降低小鼠血糖、血脂、体重、Lee’s指数、内脏脂肪指数,且BTM-0512较白藜芦醇作用更加明显。
（4）在动物实验中,与模型组相比,BTM-0512组和白藜芦醇组小鼠内脏脂肪中Sirt1、总PRDM16mRNA表达上调,而全长PRDM16、UCP1、C/EBPβ、TMEM26、Resistin表达则显著下调。
（5）在动物实验中,与模型组相比,BTM0512和白藜芦醇组小鼠棕色脂肪中Sirt1、UCP1、全长PRDM16与总PRDM16的表达皆升高,Resistin、C/EBPβ、TMEM26表达无明显差异。
四、注意事项
1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。
3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。
4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
