人脐静脉内皮细胞的复苏与冻存及其应用
一、背景
人脐静脉内皮细胞是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。TNF-α和IFN-γ等细胞因子会诱导内皮细胞激活（一种炎性反应），并导致VCAM-1/CD106等细胞黏附分子上调，这些上调可使用荧光标记抗体和细胞成像进行定量。
人脐静脉内皮细胞是采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用胶原酶Ⅰ型用消化分离得到脐静脉内皮原代细胞。胶原酶是最理想的血管内皮细胞分离酶，对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。
二、细胞复苏
从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC完全培养液4－5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×105个。
三、细胞冻存
调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含细胞的RPMI-1640液为8ml，应配冻存液8ml，其中FBS为6.4ml,DMSO为1.6ml，混匀。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。
四、应用
用于RAS-线粒体依赖的自噬对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制研究：
肾素-血管紧张素（RAS）是最常见及最重要的心脏疾病致病因子。但在血管病变中RAS的活化状态尚存争议,而对不伴心肌病变的糖尿病患者是否需要应用RAS抑制剂目前更是缺乏直接的理论依据。临床试验则证实血管紧张素转化酶抑制剂具有不同程度的血管内皮保护作用,提示RAS可能参与内皮功能损伤的进程。但RAS在体内的确切致病机制目前尚不清楚,近期的研究发现,在心肌肥厚和心衰小鼠中,线粒体氧化应激是RAS的一个值得信赖的靶点。
以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、糖尿病大鼠及无心血管、肿瘤并发症的糖尿病患者为实验对象,从组织、细胞及分子水平研究RAS-线粒体对高糖诱导的内皮细胞凋亡、衰老及自噬的影响及作用机制,并对可能的调控因子进行探讨。
研究主要探讨不同葡萄糖浓度或者高葡萄糖浓度下不同作用时间对人脐静脉内皮细胞衰老、自噬及凋亡的影响。
方法：
1、HUVEC在无血清ECM培养基中培养12小时后,加入不同浓度葡萄糖（11,16.5,22,27.5,33mM）共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分别作用72,48,24,6h。ECM培养基基础葡萄糖浓度5.5mM。同时给予33mM甘露醇作为对照排除渗透压升高的影响。
2、葡萄糖处理后,分别行细胞周期、β-半乳糖苷酶染色、细胞衰老相关异染色质聚集（SAHF）和衰老相关蛋白检测评估细胞衰老。
3、葡萄糖处理后,检测自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的表达,并分别给予AICAR、CC调控自噬启动蛋白AMPK,评估葡萄糖对内皮细胞自噬的影响。
4、葡萄糖处理后,流式细胞术评估葡萄糖对内皮细胞凋亡的影响。
结果：
1、葡萄糖呈现浓度及剂量依赖性地促进人脐静脉内皮细胞衰老,且这种促进与渗透压改变无关。
2、葡萄糖诱导自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的高表达,且独立于渗透压改变。抑制AMPK磷酸化反应可以废除高糖诱导的自噬反应。
3、培养条件下,高糖对人脐静脉内皮细胞凋亡无明显影响。
结论：本研究表明,高糖可以明显促进内皮细胞衰老、自噬,但对内皮细胞凋亡无明显影响。且内皮细胞损伤为渗透压非依赖性。
人脐静脉内皮细胞是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。TNF-α和IFN-γ等细胞因子会诱导内皮细胞激活（一种炎性反应），并导致VCAM-1/CD106等细胞黏附分子上调，这些上调可使用荧光标记抗体和细胞成像进行定量。
人脐静脉内皮细胞是采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用胶原酶Ⅰ型用消化分离得到脐静脉内皮原代细胞。胶原酶是最理想的血管内皮细胞分离酶，对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。
二、细胞复苏
从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC完全培养液4－5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×105个。
三、细胞冻存
调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含细胞的RPMI-1640液为8ml，应配冻存液8ml，其中FBS为6.4ml,DMSO为1.6ml，混匀。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。
四、应用
用于RAS-线粒体依赖的自噬对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制研究：
肾素-血管紧张素（RAS）是最常见及最重要的心脏疾病致病因子。但在血管病变中RAS的活化状态尚存争议,而对不伴心肌病变的糖尿病患者是否需要应用RAS抑制剂目前更是缺乏直接的理论依据。临床试验则证实血管紧张素转化酶抑制剂具有不同程度的血管内皮保护作用,提示RAS可能参与内皮功能损伤的进程。但RAS在体内的确切致病机制目前尚不清楚,近期的研究发现,在心肌肥厚和心衰小鼠中,线粒体氧化应激是RAS的一个值得信赖的靶点。
以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、糖尿病大鼠及无心血管、肿瘤并发症的糖尿病患者为实验对象,从组织、细胞及分子水平研究RAS-线粒体对高糖诱导的内皮细胞凋亡、衰老及自噬的影响及作用机制,并对可能的调控因子进行探讨。
研究主要探讨不同葡萄糖浓度或者高葡萄糖浓度下不同作用时间对人脐静脉内皮细胞衰老、自噬及凋亡的影响。
方法：
1、HUVEC在无血清ECM培养基中培养12小时后,加入不同浓度葡萄糖（11,16.5,22,27.5,33mM）共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分别作用72,48,24,6h。ECM培养基基础葡萄糖浓度5.5mM。同时给予33mM甘露醇作为对照排除渗透压升高的影响。
2、葡萄糖处理后,分别行细胞周期、β-半乳糖苷酶染色、细胞衰老相关异染色质聚集（SAHF）和衰老相关蛋白检测评估细胞衰老。
3、葡萄糖处理后,检测自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的表达,并分别给予AICAR、CC调控自噬启动蛋白AMPK,评估葡萄糖对内皮细胞自噬的影响。
4、葡萄糖处理后,流式细胞术评估葡萄糖对内皮细胞凋亡的影响。
结果：
1、葡萄糖呈现浓度及剂量依赖性地促进人脐静脉内皮细胞衰老,且这种促进与渗透压改变无关。
2、葡萄糖诱导自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的高表达,且独立于渗透压改变。抑制AMPK磷酸化反应可以废除高糖诱导的自噬反应。
3、培养条件下,高糖对人脐静脉内皮细胞凋亡无明显影响。
结论：本研究表明,高糖可以明显促进内皮细胞衰老、自噬,但对内皮细胞凋亡无明显影响。且内皮细胞损伤为渗透压非依赖性。
