PCR反应引物设计的六点原则和应用实例

引物：存在有自然中生物的DNA复制引物(RNA引物)和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。一般所说引物，指DNA引物。引物是 PCR反应成功与否的关键，为了保证扩增的准确性和效率，引物设计应遵循以下原则：

                    
一、引物设计：在 NCBI上搜索不同物种的相同基因，通过序列分析软件得到相同基因的序列，即为该基因的保守区。

二、引物长度：15-28 bp，大于38 bp时，退火温度升高，不利于普通 Taq酶扩增

三、引物中 GC的含量为40%-60%, Tm最接近72℃

四、由于密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位(最好是 T)

五、碱基分布不均匀，3’端不超过3 G或 C

六、引物本身不形成发夹结构，引物设计完整，要通过 BLAST验证。

PCR扩增对模板要求不高，可以采用单链或双链 DNA作为扩增片段，但 PCR可以扩增少量的 DNA，为保证扩增的专一性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：

模版可以是纯化过的样品，也可以是粗制滥造的样品，不同来源的模版采用不同的处理方法，试验模版纯化越简单越好，但模版中若有 Taq酶抑制剂，蛋白酶，核酸酶等，会干扰反应。取模时要注意保存，不要放置过久，避免反复冻融，防止降解。大多数人都会忽略这个问题，当实验结果不带条纹时，可以优先考虑是否是模板降解的原因。

实例：细菌 DNA提取法
                             

1. 取1-2 ml菌液，离心12,000 rpm 10 min，除去上清，得到沉淀

2. 根据得到的沉淀量，加入约500 ul的 TE (以下是配方)悬浮沉淀，并加入20 ul溶菌酶，30 min 37度保温

3. 加入10%的30 ul的 SDS和1 mg蛋白酶 K，混合后1 h 37度保温

4. 5 mol/l氯化钠的添加量为120 ul，完全混合，65度置10 min

5. 等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)充分混合后，12000 rpm离心5 min，在干净的 EP管中得到上清

6. 等体积氯仿：异戊醇(24:1)充分混合，12,000 rpm离心5 min，得到上清于速凝胶管

7. 加入等体积的异戊醇，充分混合，-20℃置入30 min,10000 rpm，离心5 min

8. 除去上清液，得到 DNA沉淀用70%乙醇漂洗(动作轻柔，不产生沉淀)，吸干，通常可得到3-5 ug DNA