PCR技术的革新之路—从凝胶电泳到微液滴数字PCR

PCR（聚合酶链式反应）技术是一项革命性的发明，通过PCR过程，我们可以很容易地将靶模板分子数量复制并指数放大，用于后续的研究及操作，是生命科学、农业、医学分子诊断、检验检疫的核心工具之一。

第一代PCR通过凝胶电泳（如图一所示）对PCR产物进行终点分析以获得样本核酸的定性结果，只能粗略检测核酸分子大小和含量。这种方法有三个最突出的缺点：开放式操作带来潜在的污染风险、报告信号检测灵敏度不足和不能准确定量。

图一：凝胶电泳核酸定性分析

（改自：https:// bio1151.nicerweb.com）

对这三个缺点的解决，催生了第二代PCR技术qPCR（实时荧光定量PCR）技术。如图二所示，在qPCR中，使用荧光染料或探针在封闭体系中监测每个循环后的扩增状况，具体的定量信息通过扩增信号阈值Ct获得。在得到Ct值后，待检测靶标的浓度可借助于外部校准器（如标准曲线）或内源性对照估算得到相对定量结果。当前，qPCR技术已经得到了较为广泛的应用。

图二：qPCR核酸间接定量过程

（改自：https://www.unbc.ca/genetics/training/gene-expression）

qPCR技术本身仍然存在一些不足：由于同一反应体系内不同靶模板分子共扩增导致的竞争性抑制，起始靶模板分子数量太少使扩增信号被体系本底湮没而导致假阴性结果，依赖标准曲线定量导致标准曲线的变动会造成定量结果的差异，抑制剂导致靶模板扩增效率降低从而影响定量准确性。另外，因为一个Ct值的差异会导致定量结果一倍的差别，所以实验操作误差的存在导致难以准确区分两倍以内差异的目的靶模板分子，如单倍体与二倍体，二倍体与三倍体。这些都是qPCR固有的缺陷，很难通过优化来解决。

研究者认识到反应体系分隔、终点PCR检测以及泊松统计的组合可以用来克服qPCR的上述不足，这种方法后来被称为数字PCR（dPCR），即第三代PCR技术。在数字PCR中，靶模板DNA分子被分布到多个独立微反应体系中，当微反应体系的数量足够多时，绝大多数微反应体系中最多只有一个靶模板分子。在PCR扩增一定循环数后，含有靶模板分子的微体系产生阳性信号，而没有靶模板分子的微体系产生阴性信号，通过对阴阳性信号计数并利用泊松分布校准就可得到靶DNA分子的绝对定量结果。近年来，皮升纳升级的微液滴技术为数字PCR提供了一种实用且低成本化的实施方案，即微液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）。

与qPCR技术不同，dPCR可在不借助任何外部或内源参照的情况下直接对未知样本靶标进行检测并定量。如图三所示，ddPCR技术的整体操作流程可简单地归述为：首先将含有核酸分子的反应体系分散成成千上万个纳升级的液滴；完成液滴PCR扩增反应过程；利用流式荧光检测或荧光成像检测技术将液滴判别为阳性（包含靶模板分子）、阴性（不包含靶模板分子）液滴，经过荧光信号峰值提取、统计计数和泊松分布校正直接得到未知样本中靶模板分子的浓度。通过上述流程，ddPCR技术实现对未知样本中靶标的检测和绝对定量。

图三：ddPCR核酸直接定量过程

在qPCR中，样本靶模板分子的扩增过程处于大体积反应系统中，靶模板分子的共扩增导致的竞争性抑制降低了模板分子的扩增效率，ddPCR通过将靶模板分子相互分隔在独立的微体系中完美地解决了该问题，数量充足的微体系的相互间隔使得每个靶模板分子能够单独地在一个腔室中完成扩增反应，且每个腔室中的引物、探针以及反应底物也都与其他腔室相互隔离，降低了非特异性扩增的可能。

在qPCR中，存在一些特定场合例如样本量稀少导致的起始靶模板分子数量少的情况。在这些样本稀缺场合中，靶模板分子扩增信号易被体系本底湮没而导致假阴性结果。而在ddPCR中，将靶模板分子分隔到相互独立的微体系中这一过程相当于变相实现了对靶模板分子的富集，结合对微体系反应信号独立检测的技术手段使得对单个靶模板分子的检测成为现实，从而使ddPCR达到单分子的检测灵敏度。

在qPCR中，待检样本的起始模板量需要借助梯度稀释的已知样本标准曲线来定量，因此是一种需要借助标准曲线的间接、相对核酸定量方法。这种定量方法有两个主要问题：首先，用来建立标准曲线的已知样本的量往往通过测OD值或荧光染料定量来得到，定量结果不够准确，而且得到的量并不能反应可扩增的模板量。其次，实验操作误差和系统误差也会造成标准曲线的偏移，从而导致未知样本的定量出现偏差。而在ddPCR中，在得到阴阳性液滴的判定结果并统计计数后，根据靶模板分子分散进入微体系符合泊松分布规律的原理对统计计数结果进行泊松分布校准就可直接得到待检样本起始模板量（M）的定量结果：

其中，N是总液滴数，M'是统计计数获得的“阳性”液滴数。ddPCR直接简洁的定量过程使得其起始模板量定量结果更精确。

在qPCR中，样本中一些复杂基质特别是PCR抑制剂的存在，会降低靶模板扩增效率，从而影响系统拷贝数检测灵敏度。而对于ddPCR来说，体系分隔过程将反应体系平均分配到几万个反应腔室中，这显著降低了每个微体系中PCR抑制剂的量，使得ddPCR的反应效率大大优于qPCR，释放了靶模板分子自身特异性扩增的效率。

此外，在qPCR中，一个Ct值的差异会导致一倍的定量结果差别，所以qPCR在区分两倍以内差异的靶模板分子，如单倍体与二倍体、二倍体与三倍体等特殊场合难以实现准确区分，而ddPCR直接绝对定量、单分子检测灵敏度、对于微小变化的敏感检测的特性使得其在应用于上述特殊场合中游刃有余。

数字PCR技术发展使得PCR定量完成了由间接定量到直接定量，由相对定量到绝对定量转变。数字PCR的绝对定量能力，使同一检测在不同时间、不同批次、以及不同实验室间定量结果的比对与校正更加准确。而数字PCR单分子水平的检测能力，也使它能够胜任微量核酸分子的检测。

结    语

技术革新的过程总是相似，日益提高的技术需求和日益复杂的应用场合催生着一代又一代新技术诞生。在精准医疗时代浪潮中，作为引领PCR技术格局的数字PCR技术，将为肿瘤液体活检、无创产前筛查、重症感染早期诊断、器官移植检测等重大医学问题提供强劲有力的驱动引擎。

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