数字PCR法检测基因突变和基因缺失

浏览次数：6818　发布日期：2019-8-20　来源：本站　仅供参考，谢绝转载，否则责任自负

Drop-off数字PCR检测方法的最主要优势是能够能够在一个反应中检测到基因组序列范围短的同源基因突变（包括核苷酸的缺失，插入和替换）。简单来讲，Drop-off实验包括两个针对相同扩增子的TaqMan 探针：与野生型序列互补而与突变位点不发生互补的Drop-off探针和与突变型和野生型基因都互补的Reference探针（如图1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off 探针和Reference探针都将与目标杂交，产生双重阳性信号（如图1B，蓝色群）。相反，如果存在突变的等位基因，即使一个核苷酸的突变也会阻止Drop-off探针与之杂交，因此只有Reference探针对目标基因进行退火，从而得到一个阳性信号。（如图1B，绿色群）。

图1信息说明如下：

A. Drop-off和Reference探针及引物在目标基因上的示意图（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. 2D图中显示来自双阳性野生型等位基因的荧光簇（天蓝色：蓝色和绿色）和单一的突变等位基因的荧光簇（绿色）和阴性微滴簇（黑色）。

C. 值得注意的是在微滴生成过程中，某些突变等位基因和野生型等位基因随机分布在同一液滴中，所以同一个液滴会同时显示野生型和突变型（天蓝色：蓝色和绿色）。野生型浓度可以直接由双色通道中的阳性液滴的比例获得(第三个颜色通道的阴阳性微滴数不影响浓度计算)。突变型浓度可以直接单阳性微滴的比例获得(第三个颜色通道的阴阳性微滴数不影响浓度计算)，其中已经刨除了双阳性液滴的数量。所以将双阳性液滴计算为突变阴性微滴，突变频率可能会被低估。

可以通过以下方式获取Drop off计算方法：

www.stillatechnologies.com/technical-notes 或Whale,AS,et al.,Biomol Derect Quantif. 2016 27:10:15-23获取Drop off计算方法的更多信息。

Drop-off检测KRAS，NRAS和EGFR热点突变

在临床应用中，通常检测一组有预测意义的遗传标记物跟踪治疗效果。例如：在非小细胞肺癌中，EGFR第19外显子的缺失使其对第一代酪氨酸激酶抑制剂具有敏感性。在结直肠癌中，KRAS和NRAS原癌基因突变是EGFR抗体耐药的重要指标。使用Drop-off和Naica三色多重检测系统，设计了三种包含内部质控对照（IC，Internal Control）的Drop-off数字PCR检测方法，用于检测最常见的KRAS 3号外显子、NRAS 2号外显子和EGFR 19号外显子的基因突变情况（如图2,3）。增加内部质控品（IC）可以评估由于样本中的抑制剂，从而评估方法的稳定性。

图2信息说明如下：

分别检测7个和4个最常见的KRAS 12号外显子和NRAS 3号外显子突变，以及EGFR外显子19缺失的Drop-off实验可靠性。在25ul PCR反应体系中，以95%的置信度在连续稀释范围从5%到0.25%的突变DNA中可以检测到最终浓度为1cp/ul的突变DNA。所有检测均在104copis的野生型DNA 和400copies的内部质控（来源于ØX174噬菌体）中进行，每个稀释梯度进行了3次重复。所显示的置信区间是理论置信区间的均值，该置信区间是在95%置信区间上由取样误差和分区误差组成。

图3信息说明如下：

A：三重实验中KRAS，NRAS和EGFR drop-off实验2D图。模板用的是商品化DNA（KRAS和NRAS）和来自冷冻肿瘤组织的DNA（EGFR）。WT：野生型。

B：散点图显示加入DNA内部质控品ØX174时，三色通道中的荧光信号。

由于已知在KRAS和NRAS突变热区中存在多种突变，EGFR 19号外显子中存在不同长度的缺失或者插入，Drop-off实验设计实现了用最少种类的探针达到快速、经济、有效地同时筛查多种具有临床意义的基因突变。如果需要，通过Drop-off实验确定某个样本为突变体后，即可使用序列特异性探针进行检测，从而确定DNA样本中存在的确切突变位点。

应用亮点：

● Drop-off数字PCR检测能够同时检测基因组热点区域发生的多种突变

● Drop-off实验实现了使用至少种类的探针，快速、经济、有效地筛选多种遗传变异

Naica^TM数字PCR系统可以实现加入内部质控品的同时，使用Drop-off检测方法进行临床应用中通常检测的7种KRAS突变、4种NRAS突变和发生在EGFR19外显子的缺失/插入。