组织源性正常小鼠原代真皮纤维原细胞培养实验方法

一、实验试剂
1、培养基： Primary Cell Medium + 10% FBS + 1% P/S + Primary Cell Supplement
2、冻存液： Primary Cell Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：抗小鼠Fibronectin抗体，荧光标记二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
 
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊
5、玻璃滴管
6、15ml离心管
7、200目网筛
 
三、实验流程
取材
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取皮片，削成厚度为0.5mm的皮片
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皮片浸泡在75%酒精中消毒
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1 × PBS （pH 7.4 ）清洗皮片两遍
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皮片剪成（3-5）mm×（10-15）mm大小
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置于消化液中4℃消化过夜
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剥去表皮，并刮去真皮下的其他组织
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将组织块剪成1mm3左右
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加入消化液，37℃消化至消化液浑浊
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停止消化，悬液过200目网筛
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收集细胞悬液，800rpm离心5min
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重悬细胞，重复离心一次
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重悬细胞，Trypan Blue染色计数，以5×105的数量接种于培养瓶中
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37℃，5%CO2培养
 
四、实验操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
 
2、取材：从小鼠身上取皮片，削成厚度为0.5mm左右的皮片；
 
3、材料预处理：将皮片浸泡在75%的酒精中消毒；用1 × PBS （pH 7.4 ）清洗两遍（每次约5min）以清除血细胞；
 
4、初步消化：将皮片剪成（3）mm×（10）mm大小，去除皮下组织；将裁剪好的皮块置于消化液中4℃消化过夜；第二天，取出消化好的细胞，用镊子尽可能剥去表皮，并刮去真皮下的其他组织；
 
5、再次消化：处理好后，将组织块剪成1mm3左右，加入消化液，37℃震荡消化至消化液浑浊（1h左右）；
 
6、中止消化：中止酶反应，悬液过200目网筛；

7、收集重悬细胞：收集细胞悬液，800rpm离心5min；弃上清，用培养基重悬细胞，重复离心一次；
 
8、细胞密度计数：培养基重悬细胞，0.4% Trypan Blue染色计数，以5×105的数量接种于培养瓶中。
 
9、培养：放置于37℃，5% CO2培养箱中。
 
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。细胞具备良好的透光性。
 
2、免疫组织化学鉴定：利用Fibronectin相关抗原检测。
 
3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
 
4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
 
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
 
6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
 
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
 
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察。
 
六、注意事项
1、选材注意时要将皮肤组织上的被毛去除干净，也可以使用还未长出被毛的乳鼠进行试验。
 
2、注意尽量将皮片剪成（3）mm×（10）mm大小，如太大则不利于消化，太小则不利于真皮、表皮的物理分离。
 
3、过度消化损伤严重影响成纤维细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
 
4、严格控制成纤维细胞的培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
 
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。
 
6、传代培养细胞接种量为5×104个（25cm2培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为8代，传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。