ELISA试剂盒的选择
医药研发人员，尤其是各大医药研发公司的动物模型，临床实验的研究人员在实验设计中，需要选择一些有疾病代表性的Biomarker，比如在特定适应症的临床实验中的使用率，学术文章中的发表情况。如能有效掌握一些大数据，将给实验设计的合理性提供了保证。
第一步：测什么Biomarker？
可以根据研究文献的数量和临床试验，比如TNF-a，在以下各大疾病的临床实验中，和对应文献中均有使用。当然在炎症，心血管疾病，糖尿病等疾病中的临床试验和使用最多。
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TNF-a在疾病中的应用(数据仅供参考)
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临床实验
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文献数量
|
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急性冠脉综合征
|
2
|
27
|
|
急性肾损伤
|
1
|
10
|
|
与年龄相关的记忆障碍
|
1
|
1
|
|
alpha - 1抗胰蛋白酶缺乏症
|
1
|
-
|
|
老年痴呆症病
|
1
|
5
|
|
类风湿关节炎
|
1
|
135
|
|
双相情感障碍
|
1
|
-
|
|
癌症,肛
|
1
|
-
|
|
癌、乳腺癌
|
3
|
30
|
|
癌、前列腺癌
|
1
|
15
|
|
心血管疾病
|
4
|
418
|
|
慢性肾脏疾病
|
3
|
37
|
|
慢性阻塞性肺疾病
|
3
|
23
|
|
常见的变量免疫缺陷
|
1
|
1
|
|
充血性心力衰竭
|
3
|
77
|
|
冠状动脉疾病
|
7
|
112
|
|
囊性纤维化
|
2
|
6
|
|
抑郁
|
1
|
24
|
|
糖尿病
|
9
|
100
|
|
杜氏肌营养不良症
|
1
|
-
|
|
移植物与宿主疾病
|
1
|
11
|
|
hemophagocyticlymphohistiocytosis
|
1
|
-
|
|
肝细胞癌
|
1
|
6
|
|
艾滋病毒感染
|
5
|
50
|
|
高血压
|
1
|
39
|
|
炎症
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17
|
711
|
|
间质性膀胱炎
|
1
|
-
|
|
肝硬化
|
1
|
14
|
|
肝衰竭
|
1
|
8
|
|
多发性硬化症
|
1
|
32
|
|
肥胖
|
8
|
104
|
|
骨关节炎
|
1
|
11
|
|
骨质疏松症
|
1
|
24
|
|
胰腺炎
|
1
|
6
|
|
牙周炎
|
1
|
13
|
|
牛皮癣
|
2
|
48
|
|
呼吸窘迫综合征
|
2
|
9
|
|
硬皮病
|
1
|
3
|
|
镰状细胞病
|
2
|
4
|
|
鼻窦炎
|
1
|
1
|
|
中风
|
1
|
46
|
|
蛛网膜下腔出血
|
1
|
-
|
|
紧张型头痛
|
1
|
-
|
|
创伤
|
1
|
-
|
|
溃疡性结肠炎
|
3
|
13
|
|
血管炎
|
1
|
21
|
第二步：选什么试剂盒？
以TNF-a为例，Meso Scale Discovery® Vplex电化学发光试剂盒以0.04pg/mL的灵敏度是普通ELISA（7 pg/mL左右）的100多倍。如果实验样本中的TNF-a低于7pg/mL,这就意味着实验数据会无法检测，实验没有定量结论。另外一个案例，临床常规测定普通CRP的方法检测线性一般为3~200mg/L，而预测心血管事需要更高灵敏度的CRP，超敏或高敏CRP （hs-CRP）。
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类型
|
指标（Human）
|
灵敏度（pg/mL）
|
提升灵敏度（倍）
|
|
|
超敏Vplex
|
普通ELISA
|
|||
|
炎症因子
|
IFN-g
|
0.2
|
8
|
40
|
|
IL-1b
|
0.04
|
1
|
25
|
|
|
IL-2
|
0.09
|
7
|
78
|
|
|
IL-4
|
0.02
|
10
|
500
|
|
|
IL-6
|
0.06
|
0.6
|
10
|
|
|
IL-8
|
0.04
|
7.5
|
188
|
|
|
IL-10
|
0.03
|
3.9
|
130
|
|
|
IL-12p70
|
0.11
|
5
|
45
|
|
|
IL-13
|
0.24
|
57.4
|
239
|
|
|
TNF-a
|
0.04
|
7.1
|
178
|
|
|
细胞因子
|
GM-CSF
|
0.14
|
3
|
21
|
|
IL-1a
|
0.09
|
1
|
11
|
|
|
IL-5
|
0.22
|
2
|
9
|
|
|
IL-7
|
0.16
|
5
|
31
|
|
|
IL-12/IL23p40
|
0.39
|
15
|
38
|
|
|
IL-15
|
0.17
|
2
|
12
|
|
|
IL-16
|
2.83
|
13.4
|
5
|
|
|
IL-17A
|
0.74
|
15
|
20
|
|
|
TNF-b
|
0.05
|
5.5
|
110
|
|
|
VEGF
|
1.12
|
9
|
8
|
|
|
趋化因子
|
Eotaxin
|
3.26
|
5
|
2
|
|
MIP-1b
|
0.37
|
10
|
27
|
|
|
Eotaxin-3
|
1.77
|
5.2
|
3
|
|
|
TARC
|
0.22
|
7
|
32
|
|
|
IP-10
|
0.37
|
4.46
|
12
|
|
|
MIP-1a
|
3.02
|
10
|
3
|
|
|
MCP-1
|
0.09
|
10
|
111
|
|
|
MDC
|
1.22
|
62.5
|
51
|
|
|
MCP-4
|
1.69
|
7.81
|
5
|
|
|
老年痴呆
|
Total Tau
|
1.07
|
12
|
11
|
|
Abeta40
|
5.41
|
100
|
18
|
|
|
Abeta42
|
0.516
|
100
|
194
|
|
|
血管生成
|
VEGF-C
|
11.1
|
48.4
|
4
|
|
VEGF-D
|
2.53
|
31.3
|
12
|
|
|
Tie-2
|
21.1
|
66
|
3
|
|
|
Flt-1
|
0.56
|
13.3
|
24
|
|
|
PIGF
|
0.32
|
7
|
22
|
|
|
bFGF
|
0.08
|
3
|
38
|
|
|
血管创伤
|
SAA
|
10.9
|
368
|
34
|
|
CRP
|
1.33
|
22
|
17
|
|
|
VCAM-1
|
6
|
1260
|
210
|
|
|
ICAM-1
|
1.03
|
254
|
247
|
|
第三步：检测什么样本？试验周期多长？
如需要检测的是尿液，柠檬酸盐血浆样本，需在订购前仔细查看ELISA试剂盒说明书中的验证样本。简单的说，如果ELISA试剂盒是没有用过试剂盒检测尿样，柠檬酸盐血浆，使用该试剂盒检测尿样会存在极大的风险；而且很多ELISA试剂盒中还会特别说明“不能检测柠檬酸盐血浆”。Vplex试剂盒验证过的样本有血清， EDTA血浆，肝素血浆，柠檬酸盐血浆，尿液，细胞上清液。
如自己采购抗体，开发ELISA方法学，如遇到抗体亲和力低，由于ELISA的两次洗脱将可能将抗体洗掉，大大影响实验结果。Meso Scale Discovery® 可以不用洗，2.5小时完成实验的一步法。
如实验研究周期较长，ELISA试剂盒尽量选择一个批次的，以防止不同批次间的差异。然而由于普通ELISA有效期在3-12个月，而实验周期往往在1-2年以上，一些长期临床实验项目甚至在5-10年，因而经常面临不同批次的挑战。而Meso Scale Discovery®Vplex试剂盒经过54个月稳定性测试。使用Vplex，完全可以用一个批次支持2-3年的实验。更多细节可以比较下表格：
|
|
Meso Scale Discovery®
超敏Vplex试剂盒
|
普通ELISA试剂盒
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试剂盒验证过的样本
|
血清， EDTA血浆，肝素血浆，柠檬酸盐血浆，尿液，细胞上清液
|
血清， EDTA血浆，肝素血浆，细胞上清液
|
|
实验流程
|
可以免洗，无需洗板，2.5小时
|
需要洗2次，6小时以上
|
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验证
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灵敏度，准确度精确度，基质效应和不同类型样本，特异性，54个月稳定性测试
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灵敏度，准确度精确度，基质效应和不同类型样本，特异性
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试剂盒检测稳定性数据
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54个月稳定性测试，3次冻融测试。
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无。有效期在3-12个月。
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校正数据
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使用NIBSC/WHO对照
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只有高端试剂盒才使用NIBSC/WHO对照
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正常人样本数据检测
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血清，EDTA血浆，肝素血浆，柠檬酸盐血浆，尿液
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血清，EDTA血浆，肝素血浆
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LPS刺激样本检测
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全血样本，PBMC（外周血单个核细胞），THP-1（人类单核巨噬细胞）
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无
|
美国Meso Scale Discovery(MSD)：成立于1995年，在2009年全球首次检测到人携带甲型H1N1病毒，在2013年被评为“全球前五的免疫分析品牌”。其研发的基于微孔板的电化学发光检测技术（简称：微孔板ECL ）是全面升级/替代ELISA， Western Blot，多蛋白因子检测的第三代免疫分析技术。已经广泛被医药研发中心、药物安全性评价中心、GLP实验室、合同外包企业（CRO）、诊断、生物技术企业应用于药物筛选，动物模型，药物代谢，血药浓度，免疫原性，中和实验，Biomarker筛选，抗体亲和力，疫苗评估，宿主细胞残留，诊断研究。
美国Meso Scale Discovery(MSD)部分应用方向：
1、细胞因子研究：实现多因子研究，常规灵敏度达0.05pg/ml。符合GLP要求的多因子检测。
2、信号通路研究：可实现同时检测Phospho/Total磷酸化蛋白的研究，仅需4.5小时。
3、神经退行性疾病研究：使用了脑脊液CSF等复杂基质样本检测，无基质效应。
4、药物安全性评估：符合FDA标准的高敏多指标检测。
5、免疫原性评估：可兼容高达50ug/ml高浓度血药干扰，达到<100ng/ml的ADA检测灵敏度，符合FDA要求。
6、抗体亚型分型：快速鉴定样本中不同亚型，可达0.1ng/ml的灵敏度水平
7、抗体表位分析：一次鉴定多达10种不同表位。
8、多价疫苗效价评估：缩短至1.5小时的评估流程。
9、抗体亲和力测试：基于SET方法学的亲和力测定，可分析高达10-15的亲和力样本。
10、中和抗体测定：基于细胞水平，更符合实际生物体要求。
11、细胞水平结合测试：Cell Base Binding测试，多达6log线性范围，能够鉴定细胞表面受体与对应补体结合水平及亲和力
12、生物工艺残留测定：一次检测，可鉴别多种宿主细胞以及纯化工艺中的多种蛋白残留测定，亚纳克基本灵敏度，确保鉴定有效性。
