5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA试剂盒使用说明

浏览次数：2758　发布日期：2011-9-6　来源：本站　仅供参考，谢绝转载，否则责任自负

5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA试剂盒使用说明

（德国IBL：RE59131）

1、应用范围

此ELISA试剂盒可用于人尿液中5-HIAA的体外定量检测。

2、前言

原发性类癌瘤通常都源自中肠的肠嗜铬细胞，并且大多情况都位于回肠末端中。类癌瘤通常都会分泌各种各样的吲哚，此类肿瘤的一般都明显的表现为尿液5-HIAA（五羟色胺的最终代谢产物）的分泌量升高。5-HIAA传统的检测方法是通过亚硝基萘酚的重氮化作用产生紫色。然而，人们已证明很多存在于尿液中的其它物质会干扰此反应而出现假阳性结果。人们也尝试着通过将离子交换层析和荧光分析相结合的方法来克服此问题。但这些方法灵敏度低并且耗费时间。最近，有人也介绍使用下列方法来检测5-HIAA：紫外区域5-HIAA的高效液相层析与荧光分析（或电化学分析）相结合的方法。因为尿液中存在着各种各样的干扰复合物，所以这两种方法都要求进行溶剂提取。而5-HIAA的酶联免疫检测是用于尿液中类肿瘤综合征标记物定量检测的一种全新的、简单的方法。

3、实验原理

此ELISA试剂盒利用的是竞争法原理，生物素标记抗原和未用生物素标记抗原竞争结合一定量的抗体结合位点。结合到抗体上生物素标记抗原的量与样品中被分析物的浓度成反比。反应系统达到平衡后，未结合的生物素标记的抗原用洗涤液洗去。结合了生物素标记抗原的抗体的量的测定是以抗生物素碱性磷酸酶作为标记物，以PNPP(对硝基苯酚磷酸盐)作为底物液。将未知物的酶反应活性和已知标准品的反应曲线相比较，可以得到未知物的量。

4、试剂盒成分

数量	标志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，单克隆）。
1×5ml	ANTISERUM	5-HIAA 抗血清蓝色，即用，内含：抗血清（兔），磷酸缓冲液，稳定剂。
1×5ml	BIOTIN	5-HIAA 生物素即用，蓝色，内含：磷酸缓冲液，稳定剂。
1×0.2mL	ENZCONJ CONC	酶联物浓缩型（100×）内含：碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体（羊），Tris缓冲液，稳定剂
1×7×0.5ml	CAL A-G	标准品A-G 0; 0.4; 1.0; 2.75; 7.5; 20; 55 mg/L 0; 2.1; 5.25; 14.4; 39.4; 105; 288 μmol/L 即用,内含:5-HIAA（甲基化）,稳定剂。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	质控品1+2，冻干粉，内含：人尿液（正常与非正常人的尿液），具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签.
1×2ml	METHYLRAGE	甲基化试剂，黄色，即用，内含二氯甲烷
1 x 1 mL	HCL	HCl，即用，0.1M的HCl
1 x50ml	ASSAUBUF CONC	检测缓冲液，浓缩（10 x）内含：磷酸缓冲液，BSA，稳定剂
1 x4ml	DILREAG	稀释液，即用，内含：N,N-二甲基甲酰氨
1 x50ml	WAHSBUF CONC	洗涤液，浓缩（20 x）内含：磷酸缓冲液，吐温，稳定剂
1×9	PNPP SUBS	PNPP底物片，内含：对硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物缓冲液，即用，内含：二乙醇胺，水，
1×15ml	PNPP STOP	PNPP终止液，即用，内含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
3×	FOIL	粘性金属板

5、实验所需器材（但试剂盒不提供）

移液器（20；25；50；100；1000μL）

玻璃检测用试管（12×75mm）

旋涡混合器

带储器的8通道移液器

洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统

酶标仪

双蒸水或去离子水

通风橱

吸水纸，取样吸头，计时器

6、实验前的准备说明

供手动操作和自动操作用：

注意	此96人份的检测试剂可分成3次独立的实验进行。下列体积为用四条包被板（32人份）进行一次检测所需要的试剂的量。如果客户想将标准品的量由7个减为6个，您可去掉标准品G。则实验结果的报告范围相应的减少到3000μg/L

6.1冻干粉或浓缩成分的制备

稀释	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
15ml	检测缓冲液	150ml	双蒸水	1：10	充分混合	2-8℃	2周
	炙控品	0.5ml	0.1M的HCl		静置15min，混合时避免气泡	≤-20℃	8周
15ml	洗涤液	300ml	双蒸水	1：20	加热至37℃以溶解所有的晶体（如果有必要），充分溶解。	2-8℃	4周
60μL	酶联物	60ml	检测缓冲液(已稀释好)	1：101	临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生	18-25℃	30min
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物液缓冲液		临时配置，仅能使用一次,混合时必免气泡产生	18-25℃	10min

6.2样品的稀释

样品中5-HIAA脓渡高于最高标准品的应在甲基化后用检测缓冲液进行进一步的稀释。

7、第一天

7.1质控品和病人样品的稀释（除标准外）

样品的准备将导致255倍的稀释。但这已将此考虑到标准品浓渡中。

注意	不要甲基化标准品，它已经被甲基化了。
1）	将质控品和样品分别20μL加入到相应的玻璃试管中。
2）	完成次操作步骤后，请在通风橱内继续操作。
3）	在每一支试管中加入50μL稀释液。旋涡混合器上混合。
4）	在每一试管中加入25μL甲基化试剂。加入试剂后立即混合试管内溶液。注意：反应混合物的黄颜色应当持续稳定，如果颜色迅速消失说明样品中酸的量过大。在这种情况下在向试管中加20μL甲基化试剂。
5）	盖好试管，室温（18-25℃）下温育20min
6）	在每一试管中加入5ml已稀释好的检测缓冲液。用塞子盖好是试管并旋转几次。手动或用混合器上下混合最少五次，以便液体能充分混合。
7）	完成此步骤后就可以不要才通风橱下操作了。
8）	吸取50μL上清液，立即进行ELISA实验。上清液室温下可稳定存放1h。

8.2 ELISA操作

1）	将标准品、甲基化质控品和甲基化病人样品分别50μL加入到相应的微孔。
2）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA生物素。
3）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA抗血清。
4）	盖板，小心振动包被板。2-8℃下温育一夜（16-20h）。

8、第二天

1）	移去金属板，弃取孔内反应液，用250μL洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。
2）	每孔加入150μL临时配置好的酶联物
3)	用一新的粘性金属盖板。室温环境（18-25℃）下，在轨道摇床（500rpm）上温育120min.
4)	在温育结属前大约10min的样子时，向微孔中加入酶联物。
5）	移去金属板，弃去孔内反应液，用250μL已稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。
6）	在加入底物液和终止液时，如果有条件的话，可使用8道移液器进行加液。加底物液和终止液必须按相同的时间间隔进行，避免气泡产生。
7）	在每一微孔中加入200μL临时配置好的PNPP底物液。
8）	室温（18-25℃）环境下，在轨道摇床上温育60min。
9）	在每一微孔中加入50μL PNPP终止液以终止反应。轻轻摇动包被板以混合各种成分。
10）	加入终止液后60min之内在405nm处测OD值（参考波长：600-650nm）。