AUTOMACS系统自动分选体系分选小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞

由此方法得到的阴性细胞（CD4⁺ CD25^-）可用作反应细胞或对照细胞

 

实验材料：

1.    小鼠

2.    HBSS洗涤缓冲液

3.    MACS缓冲液

4.    CD8a（Ly-2）磁珠

5.    结合缓冲液

6.    biotin-抗CD25（7D4）

7.    Streptavidin-PE

8.    抗PE磁珠

9.    完全RPMI培养基

10.    小鼠CD3⁺T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液

11.    15ml离心管，无菌

12.    autoMACS系统和分选柱

13.    30mm尼龙网或40mm预分离滤膜

 

实验方法：

1.    用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。

2.    将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

3.    将细胞悬液在4℃，200g离心10min。离心过程中，准备3支小鼠CD3⁺T细胞纯化柱，按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。

4.    用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。

5.    用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在4℃，200g离心10min。

6.    将沉淀按每10⁸个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每10⁸个细胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。

7.    4℃，200g离心10min。

8.    以MACS缓冲液混悬细胞，使细胞浓度达到10⁸个细胞/ml。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。将细胞放到autoMACS的上样通道。选择depletes程序（CD4⁺ T细胞将从阴性通道洗脱。

9.    回收细胞计数，在4℃，200g离心10min。

10.    用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到10⁸个细胞/ml。每10⁸个细胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g离心10min。

11.    用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到10⁸个细胞/ml。每10⁸个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

12.    4℃，200g离心10min.

13.    用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到10⁸个细胞/ml。每10⁸个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

14.    4℃，200g离心10min。

15.    用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到10⁸个细胞/ml。将细胞放到autoMACS的上样通道。选择posseld程序（CD4⁺ CD25⁺细胞将从阳性通道洗脱，CD4⁺ CD25^-细胞将从阴性通道洗脱。