Western Blot 实验试剂选购指南
(一)蛋白质电泳
1.请参照常规电泳操作.
2.分子量标准:
可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点:
优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率.
缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力.
购买信息:
(二)蛋白质转印
a) 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:
(尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交)
b) 膜的大小: 请根据胶的面积来确定.
c) 膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
购买信息:
(三) 蛋白质的显示(大部分实验不需要进行此步操作)
蛋白质染色的染料有很多种,各种的特点均不一样.
(四)免疫检测
有各种不同的免疫检测方法.请注意选择.方法不同,则所需的试剂也不同.如需方便,可选择完整的试剂盒.
A.封闭膜:
这一步会影响结果的成败和背景的强度.常用封闭剂为BSA和Tween20. 脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体.
购买信息:
B.一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测,必须采用非变性胶电泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原装抗体或进口分装抗体.具体请参见免疫学部分产品----第一抗体.
C.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗.
购买信息: 请参见免疫学部分试剂---各种标记抗体
D.底物系统: 采用常规底物或化学发光底物.
(1) 显色法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单,但灵敏度不高,并难以从膜上去除.
(2) 化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高,检测时可采用X光胶片或CCD成像系统.
不同显色方法产品比较如下:
推荐产品:
SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液
采用独特的发光底物系统，是世界上最灵敏的ECL Western Blot 化学发光试剂。用于Western Blotting 条带的荧光发光，检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP 的抗体及其关联的抗原。由两种溶液组成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏发光液，价格低廉，灵敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同类ECL 产品100 倍以上，也明显高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化学发光系统数倍，但背景更干净，发光时间持久，可以长达10 小时以上。
特别适用于丰度极低而一般ECL 系统难于检测的目的蛋白。
特点如下：
ж 灵敏度极高，可检测10-100 fg 抗原。
ж 高信噪比，背境干净。
ж 发光迅速。
ж 发光持续12小时以上。
ж 可在日光灯下进行发光操作。
ж 节省抗体(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。
ж 储存条件：4℃避光储存一年，偶尔室温放置数周不影响质量。
购买信息
美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列
4. Western Blotting检测试剂盒
我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可以避免各种试剂的不匹比而带来的结果不理想.
Western Blotting DAB显色法检测试剂盒
试剂盒的内容：
（1） 封闭试剂：10g蛋白质干粉2包。
（2） 浓缩抗体稀释液：20ml×2瓶，为10倍浓缩液。
（3） 过氧化物酶标记二抗。1ml。效价1：200—400
（4） DAB浓缩液10ml(×40倍)
购买信息:
注: 每盒足够10张膜或800平方厘米的膜显色, 表中所列动物IgG是指一抗的种属来源.
1.请参照常规电泳操作.
2.分子量标准:
可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点:
优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率.
缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力.
购买信息:
(二)蛋白质转印
a) 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:
(尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交)
b) 膜的大小: 请根据胶的面积来确定.
c) 膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
购买信息:
(三) 蛋白质的显示(大部分实验不需要进行此步操作)
蛋白质染色的染料有很多种,各种的特点均不一样.
(四)免疫检测
有各种不同的免疫检测方法.请注意选择.方法不同,则所需的试剂也不同.如需方便,可选择完整的试剂盒.
A.封闭膜:
这一步会影响结果的成败和背景的强度.常用封闭剂为BSA和Tween20. 脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体.
购买信息:
B.一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测,必须采用非变性胶电泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原装抗体或进口分装抗体.具体请参见免疫学部分产品----第一抗体.
C.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗.
购买信息: 请参见免疫学部分试剂---各种标记抗体
D.底物系统: 采用常规底物或化学发光底物.
(1) 显色法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单,但灵敏度不高,并难以从膜上去除.
(2) 化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高,检测时可采用X光胶片或CCD成像系统.
不同显色方法产品比较如下:
推荐产品:
SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液
采用独特的发光底物系统，是世界上最灵敏的ECL Western Blot 化学发光试剂。用于Western Blotting 条带的荧光发光，检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP 的抗体及其关联的抗原。由两种溶液组成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏发光液，价格低廉，灵敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同类ECL 产品100 倍以上，也明显高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化学发光系统数倍，但背景更干净，发光时间持久，可以长达10 小时以上。
特别适用于丰度极低而一般ECL 系统难于检测的目的蛋白。
特点如下：
ж 灵敏度极高，可检测10-100 fg 抗原。
ж 高信噪比，背境干净。
ж 发光迅速。
ж 发光持续12小时以上。
ж 可在日光灯下进行发光操作。
ж 节省抗体(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。
ж 储存条件：4℃避光储存一年，偶尔室温放置数周不影响质量。
购买信息
美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列
4. Western Blotting检测试剂盒
我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可以避免各种试剂的不匹比而带来的结果不理想.
Western Blotting DAB显色法检测试剂盒
试剂盒的内容：
（1） 封闭试剂：10g蛋白质干粉2包。
（2） 浓缩抗体稀释液：20ml×2瓶，为10倍浓缩液。
（3） 过氧化物酶标记二抗。1ml。效价1：200—400
（4） DAB浓缩液10ml(×40倍)
购买信息:
注: 每盒足够10张膜或800平方厘米的膜显色, 表中所列动物IgG是指一抗的种属来源.
