疫苗生产中抗生素残留的免疫学方法
一、疫苗的规定分类
疫苗是以病原微生物或其组成成分、代谢产物为起始材料，采用生物技术制备而成，用于预防、治疗人类相应疾病的生物制品。疫苗接种人体后可刺激免疫系统产生特异性体液免疫和（或）细胞免疫应答，使人体获得对相应病原微生物的免疫力。用于传染病预防的人用疫苗，按其组成成分和生产工艺可分为以下类型。
1. 灭活疫苗：病原微生物经培养、增殖，用物理化学方法灭活以去除其增殖能力后制成的疫苗。例如钩端螺旋体疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等。
2. 减毒活疫苗：采用病原微生物的自然弱毒株或经培养传代等方法减毒处理后获得致病力减弱、免疫原性良好的病原微生物减毒株制成的疫苗。例如钩端螺旋体疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等。
3. 亚单位疫苗：病原微生物经培养后，提取、纯化其主要保护性抗原成分制成的疫苗。例如A群脑膜炎球菌多糖疫苗、流感亚单位疫苗等。
4. 基因工程重组蛋白疫苗：采用基因重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因重组到细菌（如大肠埃希菌）、酵母或细胞，经培养、增殖后，提取、纯化所表达的保护性抗原制成的疫苗。例如重组乙型肝炎疫苗等。
5. 结合疫苗：由病原微生物的保护性抗原成分与蛋白质载体结合制成的疫苗。例如重组乙型肝炎疫苗等。
6. 联合疫苗：由两个或以上活的、灭活的病原微生物或抗原成分联合配制而成的疫苗，用于预防不同病原微生物或同一种病原微生物的不同血清型/株引起的疾病。联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗。例如吸附百白破联合疫苗、麻腮风联合减毒活疫苗，23价肺炎球菌多糖疫苗、流感病毒裂解疫苗。
二、疫苗成品的检测项目
疫苗成品检测项目一般包括鉴别试验、理化测定、纯度、效力测定、异常毒性检查、无菌检查、细菌内毒素检查、佐剂、抑菌剂及工艺杂质残留量检测等。疫苗的工艺杂质主要包括以传代细胞生产的病毒性疫苗中宿主细胞蛋白质和DNA残留，以及生产过程中用于培养、灭活、提取和纯化等工艺过程的化学、生物原材料残留物，如牛血清、甲醛和β-丙内酯等灭活剂、抗生素残留等。对于与疫苗关键质量属性相关的工艺杂质（如细胞基质残留蛋白质和细胞基质残留DNA，抗生素、核酸酶、残余牛血清等），如因产品特性无法在成品中检测时，应在适当的中间产物（如原液或半成品）取样检测，其检测结果应能准确反映每一成品剂量中的残留水平。对于一般工艺杂质，如经充分验证证明生产工艺可对其有效、稳定地去除或控制，并持续达到可接受的水平或残留水平处于分析方法的检测限以下，相关残留物检测可不列入产品的检定项目中。
三、生物制品中常用的抗生素
生物制品在菌株构建药物筛选及生产过程中，为了防止细菌污染等原因，会添加某些种类的抗生素。在预防类生物制品（疫苗）中常添加新霉素、红霉素、庆大霉素，其中红霉素可引起耳聋和周围神经炎，庆大霉素除了引起过敏之外，在临床上如果用于婴幼儿，可以造成永久性的神经性耳聋。在治疗类生物制品（如重组蛋白、单克隆抗体等）中常添加的氨苄西林、四环素、卡那霉素等，其中氨苄西林易引发过敏反应，卡那霉素影响耳蜗神经并具有肾毒性。
国家食品药品监督管理局要求在生物制品生产过程中应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低的抗生素品种，且产品的后续纯化工艺应保证可有效去除制品中的抗生素；如后续工艺不能有效去除，则不得添加。病毒性疫苗生产中仅允许在细胞制备、细胞增殖过程中使用抗生素。使用抗生素时，成品检定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限值。严禁使用青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。目前2020版《中国药典》收录了微生物培养法和酶联免疫法两种。2020版《中国药典》规定，生产过程中加入抗生素的应进行抗生素残留量检测，采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。
四、抗生素免疫学检测方法
免疫学具有高通量、操作简单、检测时间短等优势，成为疫苗生产中检测抗生素残留的常用手段。检测方法常用的包括酶联免疫吸附法、免疫层析法。
1. 酶联免疫吸附法
检测原理：通常基于竞争性免疫检测原理，以卡那霉素为例。卡那霉素与预包被在板上的卡那霉素蛋白偶联物竞争结合有限的抗卡那霉素的抗体，然后加入酶结合物反应，形成酶结合物—抗卡那霉素抗体—卡那霉素蛋白偶联物复合物，洗涤除去未结合的反应物，经TMB底物显色产生蓝色产物，加终止液后，产物由蓝色转变为黄色，其在450nm下有最大吸收峰。样本中卡那霉素含量与样本的吸光度呈负相关。
2. 免疫层析法
检测原理：以四环素为例。四环素快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的四环素在流动的过程中与胶体金标记的特异性四环素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上的四环素-BSA偶联物的结合，从而导致检测线颜色的深浅变化。当样品中不含有四环素或浓度低于检测限时，T线显色强于C线显色或与C线显色一致。当样品中的四环素浓度等于或高于检测限时，T线显色明显弱于C线显色或T线不显色。而无论样品中是否含有四环素质控线C线都会显色，以示检测有效。
疫苗是以病原微生物或其组成成分、代谢产物为起始材料，采用生物技术制备而成，用于预防、治疗人类相应疾病的生物制品。疫苗接种人体后可刺激免疫系统产生特异性体液免疫和（或）细胞免疫应答，使人体获得对相应病原微生物的免疫力。用于传染病预防的人用疫苗，按其组成成分和生产工艺可分为以下类型。
1. 灭活疫苗：病原微生物经培养、增殖，用物理化学方法灭活以去除其增殖能力后制成的疫苗。例如钩端螺旋体疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等。
2. 减毒活疫苗：采用病原微生物的自然弱毒株或经培养传代等方法减毒处理后获得致病力减弱、免疫原性良好的病原微生物减毒株制成的疫苗。例如钩端螺旋体疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等。
3. 亚单位疫苗：病原微生物经培养后，提取、纯化其主要保护性抗原成分制成的疫苗。例如A群脑膜炎球菌多糖疫苗、流感亚单位疫苗等。
4. 基因工程重组蛋白疫苗：采用基因重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因重组到细菌（如大肠埃希菌）、酵母或细胞，经培养、增殖后，提取、纯化所表达的保护性抗原制成的疫苗。例如重组乙型肝炎疫苗等。
5. 结合疫苗：由病原微生物的保护性抗原成分与蛋白质载体结合制成的疫苗。例如重组乙型肝炎疫苗等。
6. 联合疫苗：由两个或以上活的、灭活的病原微生物或抗原成分联合配制而成的疫苗，用于预防不同病原微生物或同一种病原微生物的不同血清型/株引起的疾病。联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗。例如吸附百白破联合疫苗、麻腮风联合减毒活疫苗，23价肺炎球菌多糖疫苗、流感病毒裂解疫苗。
二、疫苗成品的检测项目
疫苗成品检测项目一般包括鉴别试验、理化测定、纯度、效力测定、异常毒性检查、无菌检查、细菌内毒素检查、佐剂、抑菌剂及工艺杂质残留量检测等。疫苗的工艺杂质主要包括以传代细胞生产的病毒性疫苗中宿主细胞蛋白质和DNA残留，以及生产过程中用于培养、灭活、提取和纯化等工艺过程的化学、生物原材料残留物，如牛血清、甲醛和β-丙内酯等灭活剂、抗生素残留等。对于与疫苗关键质量属性相关的工艺杂质（如细胞基质残留蛋白质和细胞基质残留DNA，抗生素、核酸酶、残余牛血清等），如因产品特性无法在成品中检测时，应在适当的中间产物（如原液或半成品）取样检测，其检测结果应能准确反映每一成品剂量中的残留水平。对于一般工艺杂质，如经充分验证证明生产工艺可对其有效、稳定地去除或控制，并持续达到可接受的水平或残留水平处于分析方法的检测限以下，相关残留物检测可不列入产品的检定项目中。
三、生物制品中常用的抗生素
生物制品在菌株构建药物筛选及生产过程中，为了防止细菌污染等原因，会添加某些种类的抗生素。在预防类生物制品（疫苗）中常添加新霉素、红霉素、庆大霉素，其中红霉素可引起耳聋和周围神经炎，庆大霉素除了引起过敏之外，在临床上如果用于婴幼儿，可以造成永久性的神经性耳聋。在治疗类生物制品（如重组蛋白、单克隆抗体等）中常添加的氨苄西林、四环素、卡那霉素等，其中氨苄西林易引发过敏反应，卡那霉素影响耳蜗神经并具有肾毒性。
国家食品药品监督管理局要求在生物制品生产过程中应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低的抗生素品种，且产品的后续纯化工艺应保证可有效去除制品中的抗生素；如后续工艺不能有效去除，则不得添加。病毒性疫苗生产中仅允许在细胞制备、细胞增殖过程中使用抗生素。使用抗生素时，成品检定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限值。严禁使用青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。目前2020版《中国药典》收录了微生物培养法和酶联免疫法两种。2020版《中国药典》规定，生产过程中加入抗生素的应进行抗生素残留量检测，采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。
四、抗生素免疫学检测方法
免疫学具有高通量、操作简单、检测时间短等优势，成为疫苗生产中检测抗生素残留的常用手段。检测方法常用的包括酶联免疫吸附法、免疫层析法。
1. 酶联免疫吸附法
检测原理：通常基于竞争性免疫检测原理，以卡那霉素为例。卡那霉素与预包被在板上的卡那霉素蛋白偶联物竞争结合有限的抗卡那霉素的抗体，然后加入酶结合物反应，形成酶结合物—抗卡那霉素抗体—卡那霉素蛋白偶联物复合物，洗涤除去未结合的反应物，经TMB底物显色产生蓝色产物，加终止液后，产物由蓝色转变为黄色，其在450nm下有最大吸收峰。样本中卡那霉素含量与样本的吸光度呈负相关。
2. 免疫层析法
检测原理：以四环素为例。四环素快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的四环素在流动的过程中与胶体金标记的特异性四环素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上的四环素-BSA偶联物的结合，从而导致检测线颜色的深浅变化。当样品中不含有四环素或浓度低于检测限时，T线显色强于C线显色或与C线显色一致。当样品中的四环素浓度等于或高于检测限时，T线显色明显弱于C线显色或T线不显色。而无论样品中是否含有四环素质控线C线都会显色，以示检测有效。
