助力分子生物学研究的数字PCR技术介绍与应用

浏览次数：1950　发布日期：2022-10-20　来源：本站　仅供参考，谢绝转载，否则责任自负

　分子生物学作为一门新兴的边缘学科，它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官、组织、细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构(如核酸序列)，来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理状态的差异。在医学领域，分子生物学为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻变革。

　　分子生物学技术问世于20世纪80年代中期。这种以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的新技术自发现以来，已经逐步成为医学领域不可或缺的研究手段之一，利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化，为疾病研究以及进一步的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。其中，在精准医疗以及新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，分子诊断学技术得到了近一步应用，也为分子生物学发展提供了新的机遇。

　　目前常见的分子诊断技术主要为荧光定量PCR技术(qPCR)、高通量测序技术(NGS)，数字PCR (digital PCR, dPCR) 是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术，其具有高敏感度、绝对定量、高特异性、使用标本用量少等特点，在科研领域迅速得到广泛应用，是科研领域新一研究利器!

　　在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢?现在我们再也不需要去纠结这个问题了，因为数字PCR帮我们解决了。

　　数字PCR技术介绍

　　数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，其中，光度法基于核酸分子的吸光度来定量，实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值(可以检测到荧光值对应的循环数)，数字PCR是全新的定量技术，基于单分子PCR方法来定量核酸，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化的方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片内数万个微反应器或微滴中，每个反应器包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，从而实现”单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，通过分析软件计算给出目的分子的浓度或拷贝数。

　　数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅需判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。

　　那么，数字PCR可以帮助我们解决哪些科研难题呢?

　　数字PCR助力基础科研

　　(1)基因表达差异研究

　　基因的差异化表达由多种因素共同导致，并且与许多疾病的发生和发展有密切联系，对差异化表达的基因进行生物信息学以及生物统计学的分析对于研究细胞调节机制和疾病机理有着重要意义。

　　实时荧光定量PCR 常用于检测基因表达差异，但该方法一般只能检测出两倍或者更大的差异。而多数科学研究则需要检测更为微小的表达变化。数字PCR由于检测时完全不依赖传统的Ct值即可实现真正意义上的绝对定量，从而提供了比实时荧光定量PCR更精确的基因差异表达研究，尤其对于那些靶基因表达差异微小的情况：microRNA、lncRNAs等的表达分析、等位基因的不平衡表达、单细胞基因表达分析、Exosome内核酸分子定量分析等。

　　(2)拷贝数(CNV)研究

　　CNV，即拷贝数变异(Copy number variation, CNV)，是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为 1 kb 以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。CNV对于物种特异的基因组构成、物种的演化和系统发育以及基因组某些特定区域基因的表达和调控可能具有非常重要的生物学意义。

　　通常拷贝数分析依赖于琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR 等方法，但该种方法拷贝数的确定总是受到限制。其中，传统实时荧光定量PCR平台可以鉴别低拷贝数 (如0至5的拷贝数)，但更高的拷贝数需要更精确的测量。dPCR通过直接计数目标基因和参照基因的双重反应，通过计算比值，可直接得到目标基因的拷贝数，适用于更高拷贝数分析，检测精度超过±10%。

　　(3)低丰度DNA模板分子的精确定量

　　目前对于低丰度目标序列的检测，定量PCR、杂交、毛细管测序及NGS等方法都因受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求(如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性就不是很高)，而数字PCR系统通过稀释样品DNA到对应的数万个检测孔中，使得稀有的核酸序列从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及重复性。此外，也将样品中可能存在的抑制剂进行了分装，提高了数字PCR扩增对于抑制剂的耐受程度，因此可具体应用于很多临床样品(血液、尿液、粪便、痰液、脑脊液等)中对肿瘤核酸标记物的检测。一般而言，毛细管电泳和定量PCR的检测灵敏度约在10%;NGS的灵敏度可达到1%;而ddPCR的检测下限为0.001%，适用于低丰度DNA模板分子的精确定量。

　　(4)甲基化含量鉴定

　　作为表观遗传学研究中重要的一个研究方向——甲基化程度分析，现阶段有不同的方法或技术来进行研究：如传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序统计法、抗体检测法、定量PCR检测法等。这些方法皆因方法学的问题而不能获得精确的定量，而数字PCR系统通过对样品的微滴化处理及目标因子的绝对拷贝数定量，为甲基化程度的精确定量检测提供了一种全新的技术。

　　Dawne N1等人使用数字PCR进行DNA甲基化的检测。结果显示，数字PCR方法可检出低至0.5%的SNRPN启动子甲基化，其线性R2可达到0.9903，且将ddPCR结果与NGS检测结果对比，一致性强，所用DNA量更少。Liesbeth Van Wesenbeeck2等人使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化线性检测时，对比结果显示，在检测低拷贝DNA时，ddPCR准确性较qPCR更高。

　　(5)CRISPR-Cas9基因编辑结果验证

　　CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，规律间隔成簇短回文重复序列，是一种RNA引导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入、替换等，从而实现探究基因功能,修复致病基因等目的。但是，CRISPR技术也会导致有潜在危险的“脱靶”问题，带来不可预测的基因变化，因此对于CRISPR基因编辑的脱靶情况需要灵敏且精准的验证及检测。

　　目前有几种方法可供选择，其中新一代测序技术当然是金标准，但对于许多实验室而言仍然是高不可攀的，对于小型项目来说也是不切实际的。数字PCR技术可以满足这一需求。欧洲分子生物学实验室研究人员Moritz Kueblbeck开发了一种联合荧光标记蛋白和数字PCR的新方法，精准快速地实现了对基因编辑后的目的基因筛选，该方法大大地降低了检测的人力、物力和成本。

　　展望

　　总而言之，由于数字PCR具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性，目前已迅速得到广泛的应用研究，其中这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可，而在基因表达研究、拷贝数鉴定、甲基化含量鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。

　　但截止目前而言，数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新的检测方法，我们在看待数字PCR的应用前景时，更应该保持一种开放的心态，与其说数字PCR技术是一个新的研究利器，不如把它视为一种全新的技术思路和手段，在这个平台上必将有更多的应用帮助我们深入到分子生物学研究的更高层次。

　　参考文献：

　　Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”.

　　Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.

　　焱伯数字PCR平台助力科学研究

　　焱伯数字PCR采用MEMS工艺打造的纳米级微流控芯片，可将样本通过芯片微流道分散到数万个反应单元中，对每个反应单元进行独立的扩增与荧光信号的检测，对反应体系中的靶标进行绝对定量。同时，焱伯数字PCR平台秉持精密小巧工具化理念，让更多科研用户能在日常工作情境中轻松试用，使它成为有效的检测工具。