化学发光方法简介： IVD行业技术担当（下）
上一期，我们大致介绍了化学发光免疫分析的原理和优缺点，下面我们就来详细说说三种分类的不同之处。
直接化学发光免疫分析（CLIA）是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的发光标记物。其通过起动发光试剂（NaOH₂、H₂O₂）作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成， 为快速的闪烁发光。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量， 从而增加灵敏度。
CLIA开发主要包括以下几个步骤：
BeaverBeads®Streptavidin链酶亲和素磁珠
BeaverBeads®NHS生物配体快速偶联磁珠
BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠
Beaver Magnetic Seprator stand磁性分离器
①将0.5mg抗体用标记缓冲液（0.1M pH7.4 PB）预处理；
②将0.1mg的吖啶盐加入到预处理的抗体中，放置于恒温摇床中避光孵育过夜；
③标记完成后，将结合物纯化，加入BSA等蛋白保护剂，4℃避光保存。
吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光，不需要催化剂，发光系统简单。
同时这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0.4s左右发射光强度即达到最大，半衰期为0.9s左右，非常省时。
基于上述特点，为增强吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物的化学发光强度，有些在发光启动试剂中加入triton x-100、tween-20等表面活性剂。
①将磁珠包被物和吖啶酯标记物分别稀释至工作浓度，配成试剂；
②设置全自动化学发光仪，装载试剂，标准品质控品样本分别上机，选择对应的项目，直接进行检测；
③检测剩余时间及检测结果会显示在屏幕上，可通过“查询”查看历史数据，点击“导出”可将数据保存为Excel格式文件。
间接化学发光免疫分析又称化学发光酶免疫分析，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测试。常用的标记为HRP和AP，它们的底物分别为鲁米诺和AMPPD。
1 具体工艺流程：
电化学发光免疫分析（ECLIA）是电化学发光和免疫测定相结合的产物，是目前最先进的标记免疫测定技术之一。
在电极表面有电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 标记 Ab，通过 Ag-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的 Ag或 Ab 进行定量 / 定性。
ELIA 具有高度敏感，可达 Pg/ml 或 pmol ；特异性强，可重复性好，CV<5%；测定范围宽；试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长。操作简单，易于自动化。
01 直接化学发光免疫分析
直接化学发光免疫分析（CLIA）是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的发光标记物。其通过起动发光试剂（NaOH₂、H₂O₂）作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成， 为快速的闪烁发光。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量， 从而增加灵敏度。
CLIA开发主要包括以下几个步骤：
磁珠包被抗体
( 以下步骤需依据项目不同进行工艺优化 )
BeaverBeads®Streptavidin链酶亲和素磁珠
利用链酶亲和素和生物素的高特异性结合能力，BeaverBeadsRStreptavidin可与biotin标记的高纯度抗体/多肽分子或核酸分子特异性结合，并具有级联放大的作用，是一种通用的具有标记和捕获性能的固相介质原料。
根据粒径的不同，产品可用免疫检测、探针捕获、细胞分选等领域，尤其适用于化学发光免疫诊断。
BeaverBeads®NHS生物配体快速偶联磁珠
表面为NHS基团修饰的磁珠，能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化或者分析检测抗体、抗原和其他生物分子。
与传统的羧基、氨基磁珠相比，无需事先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化，只需简单讲含伯氨基的生物配体溶解于偶联缓冲液中，室温下将蛋白溶液与NHS磁珠混合即可将生物配体共价偶联到磁珠上，偶联效率可达90%以上；偶联体系pH为5-9.
BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠
具有快速磁响应性超顺磁性、良好的分散性、粒径均一、极低的非特异性吸附和丰富的结合位点等特点。在特定试剂（如EDC/NHS）作用下，将多种生物配体（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、药物分子等）共价偶联到磁珠表面。常用于检测、捕获等试验。
Beaver Magnetic Seprator stand磁性分离器
为快速分离磁珠的手工操作或高通量的自动化操作而设计的一系列不同规格的专用磁性分离工具，适用于抗体纯化、免疫沉淀、免疫共沉淀、细胞分选、核酸分离等相关实验。
吖啶酯标记抗体
①将0.5mg抗体用标记缓冲液（0.1M pH7.4 PB）预处理；
②将0.1mg的吖啶盐加入到预处理的抗体中，放置于恒温摇床中避光孵育过夜；
③标记完成后，将结合物纯化，加入BSA等蛋白保护剂，4℃避光保存。
吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物在有H₂O₂的稀碱性溶液中即能发光，不需要催化剂，发光系统简单。
同时这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0.4s左右发射光强度即达到最大，半衰期为0.9s左右，非常省时。
基于上述特点，为增强吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物的化学发光强度，有些在发光启动试剂中加入triton x-100、tween-20等表面活性剂。
上机检测实验
①将磁珠包被物和吖啶酯标记物分别稀释至工作浓度，配成试剂；
②设置全自动化学发光仪，装载试剂，标准品质控品样本分别上机，选择对应的项目，直接进行检测；
③检测剩余时间及检测结果会显示在屏幕上，可通过“查询”查看历史数据，点击“导出”可将数据保存为Excel格式文件。
02 间接化学发光免疫分析
间接化学发光免疫分析又称化学发光酶免疫分析，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测试。常用的标记为HRP和AP，它们的底物分别为鲁米诺和AMPPD。
1 具体工艺流程：
包被抗体的磁性微粒
加入样本、标准品
清洗
加入酶标抗体/生物素化抗体
洗板
加入链酶亲和素HRP
清洗
加入底物液
测试发光信号（如是板式发光可参考Elisa操作方式）
03 电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析（ECLIA）是电化学发光和免疫测定相结合的产物，是目前最先进的标记免疫测定技术之一。
在电极表面有电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 标记 Ab，通过 Ag-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的 Ag或 Ab 进行定量 / 定性。
ELIA 具有高度敏感，可达 Pg/ml 或 pmol ；特异性强，可重复性好，CV<5%；测定范围宽；试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长。操作简单，易于自动化。
