大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法！
一、实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二、实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
三、实验仪器与设备
⒈超净工作台
⒉低温离心机
⒊恒温摇床
⒋恒温箱
⒌-70℃
⒍恒温水浴器
四、实验材料
⒈氯化钙(CaCl2)
⒉胰蛋白胨
⒊酵母提取物
⒋氯化钠(NaCl)
⒌氨苄青霉素
⒍大肠杆菌DH5α
⒎pUC19质粒
⒏50ml离心管
⒐吸头、培养皿、锥形瓶等。
附试剂的配制：
⒈0.1mol/L CaCl2溶液
⒉LB液体培养基
配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g
酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
⒊氨苄青霉素（Amp）,用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。
五、实验步骤
⒈从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
⒉取0.5 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ ml,此为实验成功的关键).
⒊将菌液转移到50 ml离心管中,冰上放置10min.
⒋离心10min(4000rpm),回收细胞.
⒌倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.
⒍用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。
⒎0-4℃6000rpm，离心10min，回收细胞。
⒏用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml悬浮细胞 。（务心放冰上）
⒐分装细胞，每200μl一份。此细胞为感受态细胞。
⒑取200μl新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2μl（50ng）混匀，冰上放置30min。
同时做两个对照管：
受体菌对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水
质粒对照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl质粒DNA溶液
⒒将管放到42℃循环水浴1-2min。
⒓冰浴2min.
⒔每管加800μl LB液体培养基，37℃培养1h(慢摇)。
⒕将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。
⒖倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。
六、作业
观察在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长的菌落生长情况，并分析原因。
七、实验安排
15学时
第1天下午—第2天上午：配LB培养基，接种，液体培养
第2天上午、下午：继续培养2-3h,制备感受态细胞，转化，培养12-16h
第3天上午：观察结果
一、实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二、实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
三、实验仪器与设备
⒈超净工作台
⒉低温离心机
⒊恒温摇床
⒋恒温箱
⒌-70℃
⒍恒温水浴器
四、实验材料
⒈氯化钙(CaCl2)
⒉胰蛋白胨
⒊酵母提取物
⒋氯化钠(NaCl)
⒌氨苄青霉素
⒍大肠杆菌DH5α
⒎pUC19质粒
⒏50ml离心管
⒐吸头、培养皿、锥形瓶等。
附试剂的配制：
⒈0.1mol/L CaCl2溶液
⒉LB液体培养基
配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g
酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
⒊氨苄青霉素（Amp）,用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。
五、实验步骤
⒈从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
⒉取0.5 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ ml,此为实验成功的关键).
⒊将菌液转移到50 ml离心管中,冰上放置10min.
⒋离心10min(4000rpm),回收细胞.
⒌倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.
⒍用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。
⒎0-4℃6000rpm，离心10min，回收细胞。
⒏用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml悬浮细胞 。（务心放冰上）
⒐分装细胞，每200μl一份。此细胞为感受态细胞。
⒑取200μl新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2μl（50ng）混匀，冰上放置30min。
同时做两个对照管：
受体菌对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水
质粒对照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl质粒DNA溶液
⒒将管放到42℃循环水浴1-2min。
⒓冰浴2min.
⒔每管加800μl LB液体培养基，37℃培养1h(慢摇)。
⒕将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。
⒖倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。
六、作业
观察在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长的菌落生长情况，并分析原因。
七、实验安排
15学时
第1天下午—第2天上午：配LB培养基，接种，液体培养
第2天上午、下午：继续培养2-3h,制备感受态细胞，转化，培养12-16h
第3天上午：观察结果
