锐博生物：外泌体miRNA研究案例：肿瘤细胞分泌的exo通过其包含的miR-21促进转移前表型
锐博生物：教科书般的外泌体miRNA研究案例
近日，四川肿瘤医院的朱桂全老师在Cancer Research发表了一篇研究外泌体miRNA与癌症的文章。小编认为该研究的思路对广大外泌体研究者具有很好的参考作用，所以今天给大家带来这篇文章的详细解读。
1、首先，提取exo
方法：分别从缺氧 (1%O2) 或正常 (20%O2) 培养的OSCC(口腔鳞状细胞癌)细胞培养基上清提取exo (外泌体)，扫描电镜观察形态，Western blot检测exo marker CD63和CD81
扫描电镜观察显示提取产物直径为50～200nm。
2、缺氧肿瘤细胞分泌的exo能影响正常肿瘤细胞吗？
方法：给缺氧exo (缺氧培养的细胞分泌的exo) 添加荧光PKH67标签，孵育OSCC细胞，荧光显微镜下观察
共聚焦显微镜显示PKH67标记的exo(绿色)被OSCC细胞内化吸收。
3、缺氧exo对正常OSCC细胞迁移和入侵有何作用？
方法：敲降细胞的HIF-1α或HIF-2α，提取exo后孵育细胞，进行细胞划痕实验
缺氧exo增强细胞迁移和入侵，但敲降后exo不能。
4、为什么缺氧exo有此功能？或许是exosomal miRNA起的作用
方法：OSCC细胞株Cal-27正常或缺氧培养24h，从细胞培养基提取exo，提取总RNA，进行miRNA测序 (exo提取、测序、生物信息分析工作由锐博生物完成)
reads中非编码RNA的量。Normoxia，氧正常；Hypoxia，缺氧
Venn图(文氏图)显示两组exo的unqiue和ovelapping miRNA
heatmap(热图)显示两组exo中差异表达的miRNA。红色，高丰度表达；绿色，低表达；黑色，中间值。基因表达数据通过Illumina HiSeq2500平台二代测序(锐博生物提供)获得
qRT-PCR验证缺氧exo中表达量增强的三条miRNA
5、通过测序得到了差异表达miRNA，下一步做什么？
研究者从3条miRNA中选择了差异显著且表达最高的miR-21作为接下来的研究对象，研究它与HIF-1α、HIF-2α的关系。
敲降HIF-1α、HIF-2α，检测细胞、exo中miR-21水平；ChIP实验看相互作用
缺氧诱导细胞、exo表达miR-21，是通过HIF-1α、HIF-2α与miR-21 HRE区结合实现的。
再研究miR-21对细胞迁移与入侵的作用。
方法：敲降缺氧或正常细胞的miR-21，提取exo后孵育细胞，进行划痕实验；敲降HIF-1α、HIF-2α后再过表达miR-21，即挽救实验
miR-21是缺氧exo诱导细胞迁移、入侵所依赖的。
挽救实验。C：肿瘤细胞刮痕实验。白线：0h成像；蓝线：24h成像。D：exo处理OSCC细胞后进行侵入实验
6、细胞水平实验做完整了，接下来开展动物实验
方法：将Cal-27细胞皮下注射到nu/nu小鼠，生成60 mm3肿瘤。注射缺氧或正常exo (10ug) 到移植瘤中央，检测各种指标
肿瘤exo的miR-21诱导移植瘤的生长和转移
7、临床样本分析
从OSCC病人血清提取exo (OSCC exo)，检测miR-21水平。
OSCC exo中miR-21水平更高，此水平与T stage 、淋巴结转移及HIF-1α表达相关。
8、总结
本研究发现缺氧exo孵育细胞后有特殊的表型，对缺氧和正常exo进行miRNA测序，获得了差异表达的miRNA；接着敲降miRNA及其相关的基因，提取exo后孵育细胞，回到细胞中研究exo、miRNA的功能；最后动物肿瘤模型与临床数据进一步支持细胞实验结果，证明了低氧微环境下肿瘤细胞分泌的exo通过其包含的miR-21促进转移前行为。
缺氧肿瘤exo可以转移到氧正常区域、使非缺氧细胞转化为转移前表型
原文：Li L, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016 Mar 18.
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