MeRIP-seq+RNA-seq揭示不同品种猪肌肉发育的m6A RNA甲基化差异

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猪作为主要的肉类来源和人类疾病的理想模型，其肌肉发育研究对于农业和生物医学都至关重要。商业品种（commercial breeds，瘦肉型）和本土品种（indigenous breeds，肥胖型）之间在肌肉生长上存在显著的表型差异，为鉴定肌肉发育中的关键基因和通路提供了绝佳模型。尽管已经在转录水平上对猪肌肉进行了广泛的测序研究，但针对转录后调控，尤其是表观遗传修饰的高通量测序研究仍然较少。m6A作为真核生物mRNA中最丰富的转录后修饰，几乎调控mRNA代谢的所有方面，包括转录、pre-mRNA处理、翻译和降解。m6A修饰由一组“writers”酶复合体催化，包括甲基转移酶样3（METTL3）、METTL14、Wilms肿瘤相关蛋白（WTAP）和ZC3H13。m6A修饰可以由“erasers”酶如FTO和ALKBH5动态可逆。m6A修饰通过多种机制促进mRNA翻译。在mRNA稳定性调控方面，m6A主要通过YTHDF2促进mRNA降解。近期研究发现m6A的替代作用，即IGF2BP蛋白介导其增强mRNA稳定性和保守功能。

近日，湖北省农业科学院畜牧兽医研究所助理研究员顾浩博士为第一作者、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省洪山实验室毕延震研究员和中国科学院亚热带农业研究所印遇龙院士为共同通讯在《cells》杂志发表了题为“N6-Methyladenosine RNA Modification Regulates the Differential Muscle Development in Large White and Ningxiang Pigs”的研究论文，研究了N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰在大约克猪（Large White, LW）和宁乡猪（Ningxiang, NX）肌肉发育差异中的调控作用。研究通过MeRIP-seq技术揭示了m6A甲基化模式，并发现m6A修饰在肌肉细胞发育、肌原纤维、细胞周期和磷酸酶调节活性等方面对肌肉发育的新生儿阶段具有调控作用。特别地，研究指出m6A修饰通过YTHDF2依赖性方式加速了特定肌肉特异性跨膜蛋白WFS1降解，并鉴定出一个单核苷酸多态性（SNP）位点C21551T，该位点在WFS1基因的最后一个外显子中，导致LW和NX猪中WFS1表达水平的差异。
 

本研究鉴定了大约克猪（Large White, LW）和宁乡猪（Ningxiang, NX）不同品种新生仔猪肌肉发育过程中的差异表达基因，并通过MeRIP-seq绘制了m6A甲基化模式。研究结果表明，m6A修饰在肌肉发育的新生仔猪阶段调控肌肉细胞发育、肌原纤维、细胞周期和磷酸酶调节活性。且LW和NX猪中差异表达基因主要富集在参与蛋白质合成通路中。对MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析，共鉴定出27个差异表达且m6A修饰基因。还鉴定出一种典型的肌肉特异性包膜跨膜蛋白WFS1，在LW和NX猪中通过m6A修饰被差异调控，进一步揭示了m6A修饰以YTHDF2依赖方式加速了WFS1降解。最后鉴定了WFS1最后一个外显子中的C21551T导致m6A甲基化变化，从而影响LW和NX猪中的WFS1表达水平差异。本研究对NX和LW猪在新生仔猪肌肉发育期间的m6A修饰进行了全面分析，并阐明了m6A修饰对这两个品种WFS1差异表达的调控机制。

图1：5日龄NX猪和LW猪背最长肌特征。

图2：m6A修饰参与调控肌肉发育。

1. qPCR实验检测NX和LW猪肌肉中与m6A相关基因的表达水平。
2. 代表性NX和LW猪背最长肌切片中FTO（绿色）图像；DAPI用于核染色（蓝色）。
3. Western blotting实验结果表明，在LW猪肌肉中FTO表达水平升高，METTL4表达水平降低。
4. 使用ImageJ软件对m6A水平进行定量分析。
5. Western blotting实验结果表明，在分化后第0、2和4天，猪卫星细胞（PSCs）中FTO蛋白表达显著增加。
6. Myhc免疫荧光染色显示，FTO过表达显著增加了Myhc+细胞比例，而FTO敲低显著减少了Myhc+细胞的比例（n = 3）。* p < 0.05，** p < 0.01。

图3：mRNA m6A甲基化在LW和NX猪肌肉中的整体特征。

1. 检测NX和LW猪肌肉中m6A修饰工作流程。通过免疫沉淀(IP)纯化含m6A的mRNA片段。
2. 每组m6A peaks的平均数量。
3. 沿转录本的m6A peaks密度。
4. LW和NX猪肌肉中m6A富集的共有motifs。
5. NX-1猪染色体上m6A富集区域分布。

F-G. (F) GO和(G) KEGG富集分析，在NX-1猪肌肉样本中有2035个基因发生m6A修饰。

图4：LW和NX猪肌肉之间差异性m6A修饰的比较。

1. LW和NX猪肌肉之间差异性m6A修饰基因火山图
2. 染色体上富集区域中差异性m6A修饰基因分布。

C-D. mRNA区域中显著差异m6A peaks分布。

E. KEGG富集分析显示LW与NX猪肌肉中差异性上调的m6A修饰基因。

F. KEGG富集分析显示LW与NX猪肌肉中差异性下调的m6A修饰基因。

图5：LW和NX猪骨骼肌的mRNA中差异表达水平。

1. 差异表达的mRNA基因火山图。
2. 差异表达的mRNA基因分层聚类分析。
3. qPCR结果显示LW猪中上调的mRNA表达。
4. qPCR结果显示LW猪中下调的mRNA表达。
5. 通过GO分析富集的前30个差异表达基因通路。
6. 通过KEGG预测富集的前30个差异表达基因通路。* p < 0.05，** p < 0.01。

图6：RNA-Seq和MeRIP-Seq的综合分析。

1. 差异性m6A甲基化和mRNA表达变化的peaks数量韦恩图。
2. 四象限图展示基因分布情况。不同颜色表示RNA表达或m6A甲基化水平不同变化。
3. 热图显示了27个甲基化水平有显著差异基因的表达情况。
4. IgG作为阴性对照，通过MeRIP-qPCR验证5个m6A甲基化基因。
5. qPCR分析显示，与NX猪相比，LW猪中5个高表达上调基因的表达增加。
6. 在SH3BP4基因位点上，IGV可视化显示RNA-seq（灰色）数据和MeRIP-seq（红色和蓝色）数据。

图7：m6A修饰调控NX和LW猪肌肉中WFS1的差异表达。

1. 基因组浏览器轨迹显示WFS1基因位点的RNA-seq（灰色）和MeRIP-seq（蓝色和绿色）数据。
2. MeRIP-qPCR验证WFS1的m6A修饰。IgG作为阴性对照。
3. 检测LW和NX猪肌肉中WFS1的表达。
4. 用FB23-2或DMSO处理的PSCs中WFS1 mRNA表达的RT-PCR分析。
5. 检测用FB23-2或DMSO处理的PSCs中WFS1 mRNA降解率。
6. 在干扰YTHDF2后，检测DMSO和FB23-2处理组中WFS1的表达。
7. 两个品种仔猪共6个样本在m6A结合peaks序列和SNP位点的测序结果。
8. m6A结合peaks的SNP位点的双荧光检测。包含C或T的结合片段被克隆到pmirGLO质粒中，分别命名为pmirGLO-MutC和pmirGLO-MutT（上图）。然后，它们与阴性对照空载体（pmirGLO-WT）一起转染入PSCs，随后用FB23-2处理（红色+/−）。