蔗糖酶试剂盒实验分光光度法测定详解
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
测定意义：
蔗糖酶（sucrase）（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。
测定原理：
本试剂盒采用3.5－二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、沸水浴、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支 ，4℃保存，用时加入1.5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂4℃保存；
试剂三：液体5mL×1瓶，常温保存；
样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
加样表和测定步骤：
置于25℃准确水浴10min
混匀， 95℃水浴5min左右（盖紧，防止水分散失），冷却至室温
混匀，520nm蒸馏水调零，测定各管吸光值，ΔA=A测定-A对照，每个测定管设一个对照管。
蔗糖酶活力计算：
1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.1296x -0.12；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
测定意义：
蔗糖酶（sucrase）（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。
测定原理：
本试剂盒采用3.5－二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、沸水浴、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支 ，4℃保存，用时加入1.5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂4℃保存；
试剂三：液体5mL×1瓶，常温保存；
样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
加样表和测定步骤：
| 试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 |
| 试剂一 | 50 | 50 |
| 蒸馏水 | 50 | |
| 样本 | 100 | 100 |
| 试剂二 | 50 |
| 试剂三 | 100 | 100 |
| 蒸馏水 | 700 | 700 |
蔗糖酶活力计算：
1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.1296x -0.12；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
