免疫PCR实验步骤过程详述
免疫PCR（Immuno-PCR，iPCR）结合了 ELISA 的特异性和 PCR 的信号放大功能，在抗体上偶联了核苷酸，这种偶联物可以充当免疫反应和 DNA 扩增之间的桥梁，使ELISA法灵敏度放大1000倍。
免疫PCR原理：
夹心免疫 PCR是最常见的 iPCR形式，将捕获抗体固定在微量滴定板表面，用于结合目标分析物。随后，捕获抗体与寡核苷酸偶联的二抗结合。通过实时 PCR 扩增并检测 DNA。
一、主要程序：
（1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；
（4） PCR扩增生物素化DNA部分。
二、实验步骤：
（1）制备生物素化DNA
将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即为生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
试剂：
包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗涤液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀释液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1mg/ml）。
三、操作步骤：
（1） 包被
用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。
（2） 封闭：
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min,洗板数次。
（3） 抗原抗体反应：
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
（4） 链亲合一蛋白A结合反应：
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min,再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
（5） PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
免疫PCR原理：
夹心免疫 PCR是最常见的 iPCR形式，将捕获抗体固定在微量滴定板表面，用于结合目标分析物。随后，捕获抗体与寡核苷酸偶联的二抗结合。通过实时 PCR 扩增并检测 DNA。
一、主要程序：
（1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；
（4） PCR扩增生物素化DNA部分。
二、实验步骤：
（1）制备生物素化DNA
将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即为生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
试剂：
包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗涤液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀释液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1mg/ml）。
三、操作步骤：
（1） 包被
用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。
（2） 封闭：
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min,洗板数次。
（3） 抗原抗体反应：
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
（4） 链亲合一蛋白A结合反应：
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min,再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
（5） PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
