3T3 细胞光毒性中性红摄取试验原理及步骤介绍
3T3 细胞光毒性中性红摄取试验背景
光毒性（Phototoxicity）是指皮肤接触化学物质后暴露于紫外线下引发的毒性反应，可分为光刺激性（Photoirritation）、光过敏性（Photoallergy）和光遗传毒性( Photogenotoxicity）。
在化妆品，特别是防晒和美白产品中，光毒性风险较高，因此产品开发者对其评估极为重视。特别是在2024年国家药监局发布的新措施后，光毒性评估成为化妆品安全性评价的关键部分。
传统光毒性评价方法依赖动物实验，但周期长、成本高，动物个体化差异影响大，且不符合国内外关于试验动物的3R原则（减少、替代和优化）。随着3R原则的推广，体外替代法逐渐取代传统方法。3T3 细胞光毒性中性红摄取试验(3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity assay, 3T3 NRU Assay) 是最早通过欧盟体外替代试验有效性验证中心( European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM) 验证并被经济合作与发展组织(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD) 的“化学物质毒性试验指南”收录的体外光毒性检测方法。在OECD 指导原则432和INVITTOX实验方案78中详细描述了实验方法和预测模型。我们国家食品药品监督管理总局于2016 年11 月7 日发布了《化妆品化学原料体外3T3 中性红摄取光毒性试验方法》并把它作为第18项毒理学试验方法纳入《化妆品安全技术规范》。
光毒性（Phototoxicity）是指皮肤接触化学物质后暴露于紫外线下引发的毒性反应，可分为光刺激性（Photoirritation）、光过敏性（Photoallergy）和光遗传毒性( Photogenotoxicity）。
在化妆品，特别是防晒和美白产品中，光毒性风险较高，因此产品开发者对其评估极为重视。特别是在2024年国家药监局发布的新措施后，光毒性评估成为化妆品安全性评价的关键部分。
传统光毒性评价方法依赖动物实验，但周期长、成本高，动物个体化差异影响大，且不符合国内外关于试验动物的3R原则（减少、替代和优化）。随着3R原则的推广，体外替代法逐渐取代传统方法。3T3 细胞光毒性中性红摄取试验(3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity assay, 3T3 NRU Assay) 是最早通过欧盟体外替代试验有效性验证中心( European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM) 验证并被经济合作与发展组织(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD) 的“化学物质毒性试验指南”收录的体外光毒性检测方法。在OECD 指导原则432和INVITTOX实验方案78中详细描述了实验方法和预测模型。我们国家食品药品监督管理总局于2016 年11 月7 日发布了《化妆品化学原料体外3T3 中性红摄取光毒性试验方法》并把它作为第18项毒理学试验方法纳入《化妆品安全技术规范》。
在药品评价领域，欧洲药监局(EMA, European Medicines Agency)和国际人用药品注册技术协调会（ICH, The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use ）指导原则的生效，3T3 细胞中性红摄取光毒性试验在药物研发工业界也被广泛使用。
经过多年来数据积累发现3T3 成纤维细胞中性红摄取试验（3T3 NRU -ASSAY）与体内动物光毒性试验结果的相关性好，且操作简单、费用低、重现性好、试验周期短，它是动物皮肤光毒性试验的一种较好的体外替代方法，被国内外广泛应用于化妆品、药品的光毒性安全评价。
3T3细胞光毒性中性红摄取试验原理和判断标准
该方法的原理是通过测定在非光照( -Irr) 和光照( + Irr) 条件下，受试物对永生化小鼠成纤维细胞BalB /c 3T3（BALB/c 3T3 mouse fibroblast cell line）毒作用后，对细胞吸收中性红的能力变化绘制细胞毒性曲线，使用Phototox Version 2.0 软件计算各个受试物的光刺激因子（PIF）和平均光效应（MPE），根据判断标准表1对受试物光毒性做出预测判断。
3T3 细胞光毒性中性红摄取试验流程
格宁生物（ScreeNingBio，SNB）于2022年根据OECD 指导原则432和INVITTOX实验方案78在实验室内部成功建立、验证并一直稳定执行3T3细胞光毒性中性红摄取试验，为国内外客户提供了化妆品原料和产品、潜在新药化合物等光毒性严谨可信的评估结果。
主要实验材料
细胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培养条件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,图 1 3T3 成纤维细胞形态
细胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培养条件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,图1 3T3 成纤维细胞形态
细胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培养条件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,图1 3T3 成纤维细胞形态
验证的标准品，2 种阳性物质，1 种阴性物质，均采购于 MCE.
Instrumentation (Light source): Honle SOL500 RF2 (solar simulator 400W) and Filter H1 (UV filter at 320 nm)
主要仪器：紫外光源 HONLE 紫外线设备 SOL500，BMG 酶标仪和 Olympus 倒置显微镜CKX53.
96-孔板受试物布局：
标准品 3T3 中性红光毒性摄取试验
对数生长期的 BalB/c 3T3 成纤维细胞消化稀释用 Multidrop™ Combi 铺板至 96 孔板（-irr 细胞板和+irr 细胞板）并培养过夜，镜检如图 2
将受试物稀释到各自最高剂量，1xPBS 进行 3.162 倍梯度稀释后，用 Bravo 分别转移 100uL到-irr 细胞板和+irr 细胞板，与细胞在 37°培养箱共孵育 1 小时后，+irr 细胞板暴露于太阳模拟器下照射( UVA 总能量为 5 J·cm 2 ) 50 分钟，-irr 细胞板放置于相同温湿度条件下的黑暗处，结束后更换新鲜的完全培养基培养过夜。
第三天轻轻拍掉培养基，每个孔中加入 100μL 含有中性红的培养基并在 37℃孵育 3 小时，用 1xPBS 洗净残留的中性红，此时可以观察到受试物对中性红吸附的梯度如图 3。
第三天轻轻拍掉培养基，每个孔中加入 100μL 含有中性红的培养基并在 37℃孵育 3 小时，用 1xPBS 洗净残留的中性红，此时可以观察到受试物对中性红吸附的梯度如图 3。
每孔加入 150μL 中性红洗脱液如图 4 并在室温下震荡 10 分钟，用 BMG 酶标仪读取 540nm 波长下吸光度值，利用 Phototox 2. 0 软件计算光刺激因子( PIF)和平均光效应( MPE)预测受试物的光毒性结果。
试验结果
在评估方法建立和验证实验中，我们验证了 2 种阳性物质，1 种阴性物质，检测结果如下：
根据 OECD 指导原则 432 和 INVITTOX 实验方案 78，受试物 OD540 数值有一定的数据窗口并且 IC50 数值也在波动范围内，根据 PIF 光刺激因子可以预测受试物的光毒性和指导原则结果一致，由此证明在 SNB 实验室建立的评估方法可靠。同时在接下来的试验中，我们对阳性受试物盐酸氯丙嗪 CPZ 数据结果持续追踪如图 5 和表 4，不管是 3T3 细胞状态、盐酸氯丙嗪 CPZ图 4 加入中性红洗脱液受试物和关键试剂批次的更换（比如血清），阳性受试物都保持了数据的稳定性，证明SNB实验室试验操作的严谨性、数据的可靠性和可追溯性。
表 4 盐酸氯丙嗪 CPZ 数据结果追踪
总结：
在化妆品原料和上市产品评价领域，由于受试物大多采用外用涂抹，所以非常重视这类受试物的光毒性评价，在新药研发和药品评价领域，这方面的研究和评价也越来越受重视。体外 3T3 细胞光毒性中性红摄取试验不仅能为化妆品安全性提供保证，还能减少实验动物的使用，同时避免因个体差异造成的误差，评估结果具有可靠性、稳定性和可追溯性。
