蛋白质组学基础：快速理解DDA与DIA的方法
基于质谱(MS)的蛋白质组学实现了生物样本中蛋白质表达谱的定性定量分析，并且可以辅助研究各种不同状态下蛋白的相互作用。典型的自下而上的蛋白质组学工作流程(图1)包括几个主要步骤：(i) 从所研究的生物样品中提取蛋白质混合物，(ii) 对分离的蛋白质浓度进行测定，(iii) 通过凝胶电泳或液相色谱法对蛋白质进行分离（可选），(iv) 蛋白质酶切， (v) 质谱检测，(vi) 数据库搜索蛋白质鉴定。
图1 自下而上的蛋白质组学流程[1]
近年来，许多质谱方法从数据依赖采集(DDA)过渡到数据非依赖采集(DIA)。虽然DIA灵敏度和覆盖度高，但并不是所有的研究都适合，很多情况下DDA反而更合适。对于很多初涉质谱蛋白质组学领域的研究者来说，往往对DDA和DIA的方法难以理解，因此，本期推送我们给大家详细介绍一下这两种不同的质谱采集方法。
首先，我们要对质谱采集信号的过程有个简单的概念。简言之，我们的肽段在经过液相（LC）洗脱之后，被电离雾化成为带电离子（即母离子，precursor）进入质谱内部，首先经过一级母离子的全扫描（即survey scan），得到MS1谱图，然后针对这些扫描到的母离子，选择哪些离子去做下一步的MS2碎裂和扫描，就涉及了DDA还是DIA的问题。
DDA
DDA是Data Dependent Acquisition的缩写，即数据依赖采集，指的是在一个循环内，选取离子强度Top N的MS1母离子进行MS2碎裂与扫描（原理示意见图2），N在质谱采集方法中进行设定，一般为10-20。随着肽段流出，完成整个液相梯度内的谱图采集，产生的下机数据随后采用相应的软件完成肽段和蛋白的鉴定和定量。
图2 DDA谱图采集示意图
DDA是质谱采集方法的一种大类，与不同的实验方法结合，又可以产生不同的数据类型，满足不同的实验需求，包括常规的定性、非标记定量（LFQ）、标记定量（TMT/SILAC等）。
DDA的优势在于实验方法简单，其谱图的复杂性较低，不仅可以进行标准的搜库分析，还可以进行large search space搜索，如PTM search、酶切半特异性及非特异性搜索，甚至开放搜索。针对未知样本，则需要进行从头测序（de novo）分析。DDA的局限性在于检测动态范围有限，易损失低丰度的离子，从而产生较多的定量缺失值，导致重现性不稳定，对于复杂样本的全蛋白组鉴定深度不够。
针对DDA数据，PEAKS®软件既可以针对未知样本单独进行从头测序分析，也可以进行de novo辅助的搜库分析（DB search），以及非标记定量和各种标记定量分析。此外，PEAKS®还整合了独有的免疫肽组分析、未知翻译后修饰及突变位点检索、完整糖肽鉴定（Studio Only）（图3），满足绝大部分DDA数据的定性、定量分析需求。
DDA的优势在于实验方法简单，其谱图的复杂性较低，不仅可以进行标准的搜库分析，还可以进行large search space搜索，如PTM search、酶切半特异性及非特异性搜索，甚至开放搜索。针对未知样本，则需要进行从头测序（de novo）分析。DDA的局限性在于检测动态范围有限，易损失低丰度的离子，从而产生较多的定量缺失值，导致重现性不稳定，对于复杂样本的全蛋白组鉴定深度不够。
针对DDA数据，PEAKS®软件既可以针对未知样本单独进行从头测序分析，也可以进行de novo辅助的搜库分析（DB search），以及非标记定量和各种标记定量分析。此外，PEAKS®还整合了独有的免疫肽组分析、未知翻译后修饰及突变位点检索、完整糖肽鉴定（Studio Only）（图3），满足绝大部分DDA数据的定性、定量分析需求。
图3 PEAKS®软件DDA分析工作流
DIA
DIA的全称是Data Independent Acquisition，即数据非依赖采集，另一种说法为sequential window Acquisition of All Theoretical Fragment ions（SWATH），简单理解就是二级的采集不依赖一级信号离子的选择，而是把MS1所有扫描到的母离子按照m/z划分为若干个小的窗口，对每个窗口内的所有母离子进行二级碎裂和扫描，可以认为是无差别“攻击”（原理示意见图4）。
图4 DIA谱图采集示意图
DIA的谱图复杂度要远远高于DDA，因此在DIA方法开发的初期，数据分析基本上依赖于谱图库搜索（Spectral library）的方法，即要事先通过多组份分馏的方法将所有待分析样本的混合物进行高pH液相色谱分离，然后通过DDA的采集方法获得建库数据，使用建库数据的鉴定结果作为谱图库，然后进行DIA数据的定性和定量分析。谱图库搜索速度快、准确性高，但也存在一些局限，比如建库深度不够，建库需要额外的样品消耗、成本和机时等。随着谱图解析算法的发展，针对DIA的数据使用理论参考序列库进行直接解谱已经得到了广泛应用，深度学习模型的引入，大大提高了DIA直接数据库搜索的谱图解析率和准确性，也使得DIA de novo分析成为可能[2]。
DIA的优势在于对样本中所有多肽的无偏检测，检测动态范围广，突破了DDA对低丰度样本检测的局限，非常适合大规模、微量样本的蛋白质组学研究。但DIA对质谱硬件和软件的要求比DDA更高，综合成本相应就有所增加，此外存在很多翻译后修饰，也会导致谱图更加复杂。
PEAKS®软件支持DIA数据的谱图库搜索（Spectral Library search）、直接数据库搜索（direct DB search）、DIA数据的从头测序（DIA de novo）分析之外，还独有DIA免疫肽组的定性定量分析功能，也支持hybrid-DIA数据分析（图5）。
DIA的优势在于对样本中所有多肽的无偏检测，检测动态范围广，突破了DDA对低丰度样本检测的局限，非常适合大规模、微量样本的蛋白质组学研究。但DIA对质谱硬件和软件的要求比DDA更高，综合成本相应就有所增加，此外存在很多翻译后修饰，也会导致谱图更加复杂。
PEAKS®软件支持DIA数据的谱图库搜索（Spectral Library search）、直接数据库搜索（direct DB search）、DIA数据的从头测序（DIA de novo）分析之外，还独有DIA免疫肽组的定性定量分析功能，也支持hybrid-DIA数据分析（图5）。
图5 PEAKS®软件DIA数据分析工作流
DDA or DIA, that is the question.
作为质谱蛋白质组学研究的两大类方法，DDA和DIA各有优缺点，并没有绝对的好坏之分，适合的才是最好的。DIA更加适合进行需要高覆盖率和定量准确性的大规模蛋白质组学研究。Rebecca C. Poulos等 (2020) [3]将卵巢癌组织、前列腺癌组织和酵母蛋白按照不同比例混合，以HEK293T细胞蛋白作为对照，历时4个月，在6台质谱仪上共采集了1560针DIA数据，期间还穿插了5000多针其他样品的数据采集。数据分析结果显示，在短时间内获得的DIA-MS数据重现性和定量准确性均较高，但随着采集间隔时间的延长和仪器性能的变化，CV值会累积增加，因此对于大队列、长时间的数据采集，仍需要开发合适的归一化校正方法。
(Rebecca C. Poulos等,2020)
DDA 更加适合需要高灵敏度和准确性的小规模研究，尤其是对于纯化蛋白、翻译后修饰组学的研究。此外，DDA可搭配各种不同的标记实验方法，提升定量的稳定性。Matthias Mann等 (2023)[4]使用DDA 分析了小鼠心脏、骨骼肌等7种组织线粒体的全蛋白组和磷酸化蛋白组，共鉴定到1266个线粒体蛋白，超过MitoCarta 3.0数据库中的92%，且定量CV小于20%。线粒体磷酸化蛋白质组表现出广泛的线粒体内磷酸化，且与融合和裂变的组织特异性调节有关。该研究是 DDA 对细胞器蛋白质组及磷酸化修饰高灵敏鉴定的典型示例。
（Matthias Mann等,2023）
划重点
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参考文献
参考文献
- Dupree, E.J.; Jayathirtha, M.; Yorkey, H.; Mihasan, M.; Petre, B.A.; Darie, C.C. A Critical Review of Bottom-Up Proteomics: The Good, the Bad, and the Future of This Field. Proteomes 2020, 8, 14. https://doi.org/10.3390/proteomes8030014
- Tran, N.H., Qiao, R., Xin, L. et al. Deep learning enables de novo peptide sequencing from data-independent-acquisition mass spectrometry. Nat Methods 16, 63–66 (2019). https://doi.org/10.1038/s41592-018-0260-3
- Poulos, R.C., Hains, P.G., Shah, R. et al. Strategies to enable large-scale proteomics for reproducible research. Nat Commun 11, 3793 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-17641-3
- Hansen, F. M., Kremer, L. S., Karayel, O., Bludau, I., Larsson, N.-G., Kühl, I., & Mann, M. (2024). Mitochondrial phosphoproteomes are functionally specialized across tissues. Life Science Alliance, 7(2), e202302147. doi:10.26508/lsa.202302147
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