珍珠蚌肉水解产物中抗氧化肽的抗氧化机制详解
任何进行有氧呼吸的生物体都会产生自由基[1]。抗氧化防御系统在清除活性氧(ROS)和防止细胞损伤方面起着重要作用。ROS过量会导致氧化损伤，引发DNA、RNA、膜脂等生物分子的氧化，进而引起机体紊乱，导致机体早衰或癌症、动脉粥样硬化、糖尿病等疾病[2]。因此，需要摄入足够的抗氧化剂来预防或减缓ROS和自由基引起的氧化应激。虽然丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)和丁基羟基异醇(BHA)等抗氧化剂可以降低食物中自由基的水平，但它们对人体健康有潜在毒性[3,4]。近年来，从动物、植物或微生物等天然来源中提取具有抗氧化特性的多肽[5]等作为抗氧化剂已成为研究热点。越来越多的研究表明，通过酶法水解食源性蛋白可制备具有抗氧化活性的生物活性肽[3]，既能保证生物活性，又具有公认的营养特性。
本期推送为大家介绍一篇对马氏珍珠 (Pinctada martensii)蚌肉水解液中新型抗氧化肽的鉴定与抗氧化特性的研究。研究发现抗氧化肽具有良好的细胞抗氧化活性(CAA)，在AAPH诱导的氧化损伤模型中，抗氧化肽显著提高了HepG2细胞的活力。从分子对接的抗氧化机制来看，抗氧化肽与自由基(DPPH和ABTS)、抗氧化酶(CAT和SOD)和抗氧化通道蛋白(Keap1)紧密结合，表明抗氧化肽具有多重抗氧化活性。多肽鉴定质谱数据用PEAKS®️ Studio进行分析。
（图文摘要）
抗氧化肽提取与抗氧化活性研究
图2 低分子量多肽分离
抗氧化活性肽序列鉴定与理化性质
表1 质谱鉴定潜在的抗氧化肽
抗氧化肽对细胞抗氧化活性（CAA）的影响
图3 抗氧化肽对HepG2细胞抗氧化活性的评价
抗氧化肽对AAPH诱导的细胞损伤的保护作用
由于实际情况下氧化损伤的强度往往不同，分别用10 mM和0.25 mM的AAPH构建细胞活力为80%和50%的损伤模型[7,8]，并在此基础上比较不同程度氧化损伤的抗氧化肽的细胞保护作用。在50%细胞活力模型中，0.2 mg/mL抗氧化肽SPSSS、SGTAV、TGVAS、GGSIT、NSAA和GGSLT处理后的细胞活力分别从49.51%提高到73.52%、73.61%、64.69%、66.35%、70.55%和68.25%，均优于阳性对照组(GSH)的57.60%（图4B）。在80%细胞活力模型中，0.2 mg/mL抗氧化肽SPSSS、SGTAV、GGSIT和NSAA处理后的细胞活力分别从79.41%提高到101.09%、107.43%、96.06%和100.09%，均优于阳性对照组(GSH)的92.08%（图4C）。其中，抗氧化肽SPSSS、SGTAV、NSAA均能将损伤细胞的活力恢复到正常细胞水平，表明其细胞保护作用尤为突出。因此，作者进一步研究了SPSSS、SGTAV和NSAA对HepG2细胞内抗氧化酶CAT和SOD的影响。
图4 抗氧化肽对损伤细胞的保护作用
如图5所示，AAPH损伤组SOD、CAT含量极显著低于对照组(p < 0.01)。在50%细胞活力模型中，0.2 mg/mL抗氧化肽SPSSS、SGTAV和NSAA分别使CAT活性从60.10%提高到103.62%、93.06%和82.53%，SOD活性从79.44%提高到95.12%、95.70%和95.96%。在80%细胞活力模型中，0.2 mg/mL抗氧化肽SPSSS、SGTAV和NSAA使CAT活性分别从74.45%提高到107.88%、98.96%和102.04%，SOD活性分别从86.25%提高到131.86%、131.24%和125.07%。其中，抗氧化肽SPSSS对CAT活性的增强效果最好。同时，抗氧化肽SPSSS、SGTAV、NSVAA可使细胞SOD活性恢复到正常水平。
图5 抗氧化肽AAPH损伤细胞中抗氧化酶的影响作简介
抗氧化机制的分子对接模拟
前述实验表明SPSSS、SGTAV和NSAA表现出良好的化学和细胞抗氧化能力，但其分子机制尚不清楚。因此，本研究通过预测抗氧化肽与自由基(DPPH和ABTS)、抗氧化酶(CAT和SOD)以及抗氧化相关蛋白(Keap1)的相互作用，探讨了抗氧化肽的分子机制。
与DPPH和ABTS自由基的分子对接结果如图6所示，SPSSS、SGTAV和NSAA的氨基酸残基与自由基形成氢键或疏水相互作用，可能在自由基清除活性中起重要作用。
图6 抗氧化肽与自由基结合模拟
与抗氧化酶CAT的对接位点HIS193、GLN441、THR444、VAL449与相关报道[9]一致（图7左），与SOD的作用位点VAL7、ASN51、VAL146与相关报道一致[10]（图7右）。表明抗氧化肽与SOD和CAT结合，具有保护或增强抗氧化酶活性的作用。
图7 抗氧化肽与抗氧化剂的结合模拟
Keap1是细胞氧化应激反应的主要调控因子，与Nrf2结合形成的Keap1-Nrf2/ARE信号通路是机体抵抗氧化损伤的重要防御系统。它可以调节抗氧化酶(如SOD和CAT)的表达，也是预防癌症或糖尿病等慢性疾病、呼吸系统疾病和神经退行性疾病的重要靶点。与Keap1分子对接结果如图8所示，作用位点TYR334、SER363、ASN382、SER383、ASN387、ARG415、TYR572、PHE577与相关报道中Keap1的结合位点一致[11,12] 。
图8 抗氧化肽与抗氧化蛋白的结合模拟
总结
综上所述，从珍珠蚌肉酶解物中可以分离得到良好的抗氧化肽，其中SPSSS、SGTAV和NSAA可能通过清除自由基、提高抗氧化酶活性、调节Keap1-Nrf2通路等方式发挥抗氧化作用。虽然多肽的结构相对稳定，但在多肽的应用中需要考虑多肽的加工稳定性和胃肠道消化吸收。因此，珍珠蚌肉的抗氧化肽能否在生物体的胃肠道消化中保持良好的生物活性还有待进一步研究。必要时，可以利用多肽包埋技术和递送系统的构建来保护目标多肽的活性。未来，抗氧化肽有望成为新型功能食品、化妆品和医疗产品的原料之一。
原文链接：https://www.mdpi.com/1420-3049/28/2/864
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