ELISA实验过程中封闭的原理及封闭剂的选择探讨

封闭（blocking）是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA试剂盒其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的目的是避免高背景和非特异性条带。

封闭的原理：

1、固相载体表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通过电转或包被，胶上的蛋白被转移到了膜上，或抗原/抗体固定在板上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。

2、蛋白塞进了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些孔洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

3、封闭液中的蛋白可以与表面上的空白空洞位置结合，同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这4、样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。

封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

在免疫学实验中，通常使用封闭剂来减少非特异性结合。常用的封闭剂有脱脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段单链二抗等。根据不同的平台选择相应的封闭剂。

1、脱脂奶粉

作用原理：脱脂奶粉含有多种蛋白，可以封闭未吸附蛋白的固相载体（WB 膜、ELISA 板等）位点，减少抗体与之结合的概率，避免非特异性结合带来的高背景。

优点：价格便宜，因含多种不同分子量的蛋白，故封闭起来更全面。

缺点：成分复杂，适用范围窄。不适用于生物素和碱性磷酸酶标记的抗体系统。且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的生产中较少应用。

2、牛血清白蛋白BSA

作用原理：同脱脂奶粉，封闭未吸附蛋白的固相载体位点。

优点：成分单一，适用于 ELISA 实验，生物素、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或者其他对特异性要求较高的实验。

缺点：大部分 BSA 中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，造成一定背景。

3、动物血清

作用原理：

1、待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，血清和 BSA 没有明显区别；

2、待检样本中可能会有 Fc 受体，可以和抗体恒定区结合，而封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本 Fc 受体之间结合。BSA 则无法封闭 Fc 受体。

优点：因为血清可以封闭 Fc 受体及减少抗体间的非特异性结合，故在免疫组化、免疫荧光实验中有广泛应用。

缺点：某些封闭血清中可能含有叠氮钠，因此不适用于 HRP 酶标的检测体系。

4、Fab 片段单链二抗

作用原理：由于二价的抗体（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有两个结合位点，不能用来封闭。而 Fab 片段单链二抗只有一个结合位点，因此可完全封闭免疫球蛋白。

应用：在 IHC 或 IF 双标/多标实验中，封闭样本表面的免疫球蛋白，封闭组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白，并可解决两个一抗来自同一种属的麻烦。

5、无蛋白封闭剂---新型高效封闭剂

Blocker 无蛋白封闭剂，该封闭剂是通过化学合成高亲水性化合物，不存在生物封闭剂所担心的生物安全性、质量、批间差等问题。

主要特点：

1）与微球表面活化的羧基偶联形成稳定的共价键
2）纯化学合成，批间差小，纯度高
3）空间结构简单，更充分的封闭微球表面，降低微球非特异性吸附，减少基质干扰
4）提高试剂灵敏度
5）含大量亲水基团，有利于提高试剂稳定性

应用领域：乳胶免疫比浊试剂/ 化学发光试剂 ，代替 BSA 作为封闭剂或与 BSA 联合封闭。

6、免疫试剂稳定液

免疫试剂稳定液主要用于免疫分析检测试剂/抗原/抗体/蛋白的保存.  该产品属于即用型，无需稀释，使用简单方便，将待保存物质溶于稳定液中后置于冰箱即可。免疫试剂稳定   液有利于维持蛋白的三维结构，保持蛋白的生物活性，可延长免疫分析试剂及蛋白的使用期限，确保产品的性能。

应用领域:

1）免疫分析试剂保存, 如免疫比浊检测试剂/化学发光检测试剂
2）蛋白质保存，如抗原/抗体/酶类等