叶绿素荧光仪和光合仪高分应用文章集锦（2024年4月）
本文我们将回顾一下4月份德国WALZ调制叶绿素荧光仪参与发表的7篇高分文章，其中Nature Communications 2篇，Advanced Science 1篇，The Plant Cell 1篇，The Plant Journal 1篇，Journal of Experimental Botany 2篇。德国WALZ制造的PAM调制叶绿素荧光仪在光合作用研究领域遥遥领先~遥遥领先~
在植物的光合作用中，循环电子传递(CET)是一种重要的代谢途径，它能够在不产生NADPH的情况下，通过PSI回收电子，维持叶绿体膜上的质子梯度。这一过程对于植物适应不同光照环境、保护光系统免受光损伤具有重要意义。2024年4月1日，日本京都大学的研究人员在The Plant Journal上发表了题为Critical role of cyclic electron transport around photosystem I in the maintenance of photosystem I activity的研究论文。该研究通过对拟南芥中的PROTON GRADIENT REGULATION 5 (PGR5)基因进行敲除(KO)突变体研究，发现了PGR5在CET中的关键作用。
研究团队首先利用CRISPR-Cas9技术生成了两个PGR5的KO等位基因突变体，分别为pgr5-5和pgr5-6。结果显示，这两个KO等位基因突变体与原有的pgr5-1突变体相比，在非光化学淬灭(NPQ)的诱导上受损程度较轻。这表明PGR5蛋白可能通过影响NPQ的大小来调节CET。为了进一步探究PGR5的功能，研究者通过遗传分析发现，pgr5-1突变体中存在第二个影响NPQ大小的突变位点，位于pgr5-1位点下游(south)约21 cM(centiMorgans)处。此外，研究还发现，编码甘氨酸-130-丝氨酸变化的pgr5-1等位基因的过表达与pgr5-5的表型互补，这表明pgr5-1突变破坏了PGR5 的稳定性，但突变蛋白保留了部分功能。而pgr5-1突变体的表型主要是由于PGR5G130S蛋白水平较低所致。研究还发现，同时缺乏PGR5和NDH复合体(另一种CET途径)的双突变体在不含蔗糖的培养基上生长严重受损。这些双突变体的PSI活性显著降低，而PSII活性仅轻微受损。这表明CET对于维持PSI活性至关重要。
这项研究不仅揭示了PGR5在调节CET中的关键作用，还为理解植物如何适应不同光照环境提供了新的视角。通过进一步的研究，我们有望开发出新的策略，通过遗传操纵来增强植物的光合作用，从而提高作物产量和适应性。
北欧常绿针叶树在季节交替中一直都面临着生存环境的巨大变化。特别是在冬季对温度和光照变化的响应。这些植物通过在分子水平和整个植物层面上调节光合作用反应来适应环境，包括光系统I(PSI)和光系统II(PSII)的光化学过程，以及卡尔文循环中的二氧化碳同化。在低温抑制酶活性但针叶树叶片仍吸收阳光的情况下，维持光合装置不同组分之间的能量平衡至关重要，否则会导致光系统过度激发和电子积累，引起氧化损伤和PSII及PSI的光抑制。为了应对冰冻温度和过量光照条件，北欧针叶常绿植物在季节尺度上动态调整其光合蛋白复合物，并启动一系列光保护机制，包括：1.可逆和持续的非光化学猝灭(NPQr和NPQs)的结合，防止PSII过度激发；2.将电子从线性电子流(LEF)重新路由到替代电子流(AEF)，将电子分流到除用于卡尔文循环中二氧化碳同化的NADP+之外的其他受体；3.上调循环电子流(CEF)，将电子在PSI周围循环回到质体醌(PQ)池。AEF和CEF通过不同的分子途径防止电子在电子传输链中积累，并在环境应激条件下促进光保护功能。尽管先前对北欧针叶常绿植物季节性适应的研究强调了AEF和CEF的重要性，但PSI和PSII的潜在动态仍未解决。2024年4月2日，芬兰图尔库大学的Eva-Mari Aro实验室在Journal of Experimental Botany杂志发表题为Accounting for photosystem I photoinhibition sheds new light on seasonal acclimation strategies of boreal conifers的研究论文，文章结合叶绿素a荧光、P700差吸光测量和关键类囊体蛋白丰度的定量等技术手段，研究了Pinus sylvestris和Picea abies在春季光合作用恢复期间PSII和PSI 的动态。值得注意的是，本研究引入并应用了一套校正后的PSI量子产率计算公式，这扩展了P700差分吸收测量的分析，并允许在北欧针叶树中识别季节性PSI光抑制。
PSI的光抑制是一个相对独立的因素，有关的文献报道也比较少。在本研究中，研究人员重点关注的因素正是PSI的光抑制。PSI光抑制会影响根据P700测量值估算PSI的量子产率，而且这种影响可能是非常动态的，这可能会干扰我们在北欧常绿针叶树中分辨PSII和PSI在季节尺度上动态变化的能力。估算PSII和PSI量子产率的方法乍看起来可能非常相似，因为两者都基于PAM技术和饱和脉冲，可以量化最小信号水平(Fo或 Po)、稳态信号水平(F或P)和最大信号水平(Fm、Fm'或Pm、Pm')之间的振幅变化。然而，PSII和 PSI信号解读所依据的生物物理原理和假设通常是不同的。其中很重要的一点区别是PSI量子产率的原始定义假定YImax为常数，而PSII的等效表达式(YIImax，通常称为 Fv/Fm)是可变的。
最大YI值恒定的假设不可避免地会导致PSI量子产率的定义不考虑PSI光抑制作用，这相当令人吃惊，因为PSI光抑制作用被广泛认为与最大氧化还原活性PSI分数或ΔPm的降低一致。忽略PSI光抑制作用会导致PSI量子产率失真，以前曾将其描述为PSI的“漏斗效应”。如果不考虑这种现象，就会严重限制我们对PSI的调控能力以及PSI和PSII产量之间关系的研究，尤其是在无法事先排除PSI光抑制的条件下，例如在越冬北方针叶树中。
通过新提出的公式分析相关研究结果发现，尽管PSI光抑制导致PSII和PSI核心复合物的化学计量发生了很大的季节性变化，但PSII和PSI光化学产量的季节性动态基本保持平衡。同样，在考虑了PSI光抑制因素后，之前报道的循环电子流季节性上调不再明显。总之，该研究的结果强调了考虑PSII和PSI 的动态以阐明越冬常绿植物光合作用的季节适应性的重要性。除了针叶树之外，作者校正的PSI量子产率为今后旨在阐明PSI动态调控的研究提供了更多工具。
光合作用是植物生长和生存的关键过程，而光系统II(PSII)是这一过程的核心。光系统II(PSII)复合体在光合生物中起着至关重要的作用，它催化水分子向质体醌的电子转移，从而激发光合作用过程中的电子传递。PSII的组装是一个复杂的过程，首先形成D2-Cyt b559亚复合体，作为D1和PsbI的受体复合体。D1的前体(pD1)在翻译过程中与D2-Cyt b559亚复合体共翻译整合，形成PSII反应中心。PSII反应中心蛋白D1含有五个TMDs，其共翻译插入过程已得到深入研究。在D1的第一个TMD从核糖体通道中出现之前，核糖体通过与核糖体蛋白L420的相互作用与cpSRP54结合，然后D1的核糖体新生链(RNC)通过SRP受体cpFtsY被引导到类囊体膜中的SecY/E转位子。尽管PSII核心亚基D2、CP43和CP47被认为可能是共翻译组装的，但目前尚不清楚SecY/E-cpSRP54靶向机制是否参与它们的翻译和组装，以及这些亚基的跨膜结构域如何通过分子伴侣调节整合到膜中。2024年4月10日，Nature Communications在线发表上海师范大学彭连伟教授实验室题为Thylakoid protein FPB1 synergistically cooperates with PAM68 to promote CP47 biogenesis and Photosystem II assembly的研究论文，文章揭示了一个新的蛋白质FPB1(Facilitator of PsbB biogenesis1)，它在PSII的组装中扮演着重要角色，它是PSII积累所必需的。
研究人员通过遗传和生化实验发现，FPB1与已知的PAM68蛋白协同作用，共同促进了CP47—PSII核心亚基的生物合成。在缺乏FPB1和PAM68的情况下，CP47的合成速率降低，且无法形成功能性的PSII复合体，导致植物无法进行有效的光合作用。这项研究还发现，FPB1是一种位于叶绿体内膜的蛋白质，它与PAM68、SecY/E转位子和Alb3整合酶相互作用，可能协助CP47在翻译过程中顺利嵌入叶绿体内膜。此外，通过核糖体剖析技术，研究人员观察到在没有FPB1和PAM68的情况下，核糖体在翻译CP47时出现明显的暂停，这表明这两个蛋白在促进CP47的共翻译插入中起着关键作用。下图为本研究提出的叶绿体中CP47的共翻译组装以及FPB1和PAM68功能的可能模型。
A hemoprotein with a zinc-mirror heme site ties heme availability to carbon metabolism in cyanobacteria (Nature Communications, IF=16.6)
蓝藻是多种生物地球化学循环的重要贡献者，海洋蓝藻占海洋净初级生产力的 25%。为了发挥这些功能，蓝藻对铁的需求量通常超过其他细菌，而且必须确保铁辅助因子(如血红素)的生物合成与需求相匹配，例如用于合成光合和呼吸作用复合体。除了在电子传递中发挥重要作用外，铁辅助因子(如血红素)还参与多种细胞功能。例如，血红素是一种关键的信号分子，可调节从转录到信号传感以及重要蛋白质翻译后调控等各种细胞过程。因此，光合生物体内进化出了涉及血红素的调节机制，以维持最佳的光合效率，同时抑制氧化应激和光损伤。在陆生植物中，进化出了一种依赖血红素的机制来控制谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR1)的丰度，这种蛋白质启动了四吡咯生物合成的第一步。GluTR1的翻译后调节对于防止血红素及其中间产物的过量产生至关重要。这种依赖血红素的负反馈调节依赖于 GluTR1 结合蛋白(GBP)，它与GluTR1的调节结构域结合后，可防止GluTR1被Clp蛋白酶降解。血红素与GBP结合会抑制这种相互作用，导致GluTR1降解。GBP由一个N 端分叉桶状结构域(吡哆胺磷酸氧化酶样家族的一部分)和一个功能未知的C端结构域DUF2470组成。这两个结构域也存在于参与细菌血红素降解和铁获取的HugZ样蛋白家族中。DUF2470与不同的分子功能有关；该结构域被认为部分屏蔽了HugZ的血红素结合口袋，而在GBP 中，DUF2470则参与识别GluTR1。虽然血红素与GBP的结合已被证实，但血红素结合形式尚未从结构上确定，而且目前还不确定这两个结构域中哪一个结合了血红素。因此，DUF2470的结构-功能关系尚未确定。4月12日，Nature Communications在线发表美国能源部联合基因组研究所Crysten E. Blaby-Haas实验室题为A hemoprotein with a zinc-mirror heme site ties heme availability to carbon metabolism in cyanobacteria的研究论文。文章研究团队通过结合系统发育基因组学方法和结构技术，鉴定了一个二聚体血红素蛋白家族，其中包含一个功能未知的DUF2470结构域。血红素铁由两个锌结合的组氨酸残基轴向配位，形成一个明显的双重对称锌-组氨酸-铁-组氨酸-锌位点。结合结构引导的体外和体内实验，研究人员进一步证明了Dri1的血红素结合与蓝藻聚胞藻中琥珀酸脱氢酶的翻译后调节之间存在功能联系，表明光合作用和呼吸之间存在铁依赖性调节关系。鉴于在真核生物和原核生物中普遍存在含有同源结构域和血红素代谢的蛋白，研究人员提出DRI（与铁相关的结构域;以前称为DUF2470）在分子水平上作为血红素依赖性调节结构域发挥作用。
此外，更详细的研究结果表明Dri1能够结合血红素，并且其晶体结构显示了一个锌镜血红素位点。这种结合是通过锌离子和特定的组氨酸残基介导的。Dri1与琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)的翻译后调控有关，暗示了一种铁依赖性的光合作用和呼吸作用之间的调控联系。Dri1的结构相关的结果表明Dri1在没有血红素时为单体，而结合血红素后形成二聚体。通过X射线晶体学和小型角X射线散射(SAXS)分析了Dri1及其变异体的结构。研究提出了Dri1作为血红素依赖性后转录调控因子的模型，可能通过直接或间接影响琥珀酸脱氢酶复合物的活性来参与电子传递链的调控。Dri1在蓝藻细菌中的作用包括对光合作用和呼吸作用的电子流的直接影响或间接影响，以及在铁限制条件下对细胞生长的影响。Dri1蛋白在蓝藻细菌中的绝对保守性表明，该蛋白在血红素稳态中发挥着关键且保守的作用。
Unique photosynthetic strategies employed by closely related Breviolum minutum strains under rapid short-term cumulative heat stress (Journal of Experimental Botany, IF=6.9)
共生藻类是珊瑚和海葵等一系列刺胞动物宿主的胞内共生微藻，提供光合固碳以换取宿主提供的氮。这些藻类对胁迫的耐受水平对其宿主的生存至关重要，尤其是在夏季热浪期间，热浪往往会导致共生藻与珊瑚宿主之间的生物群落失调，造成白化现象。例如，Durusdinium属中的物种通常比Cladocopium属中的物种赋予宿主更高的白化耐受性，Cladocopium C15辐射中不同成员的存在与珊瑚不同的热耐受性有关。共生藻类植物的耐热性取决于它们在热胁迫下保持光合系统II的最大光合产物率(Fv/Fm of PSII)和高水平碳固定的能力。2024年4月18日，Journal of Experimental Botany杂志在在线发表墨尔本大学生物科学学院为署名单位，标题为Unique photosynthetic strategies employed by closely related Breviolum minutum strains under rapid short-term cumulative heat stress的研究论文。
该研究文章的核心内容是关于三种密切相关的Breviolum minutum藻株在快速短期累积热应激(26-40°C)下所采用的独特光合作用策略。研究比较了这些藻株的热耐受性、光化学和非光化学淬灭、光合色素的脱环氧化状态以及活性氧物质(ROS)的积累。主要发现和结论包括：不同的B. minutum藻株采用了不同的光保护策略，导致了它们各自的上部热耐受性不同。研究提供了之前未知的热耐受性特征和光保护机制之间的相互依赖性，包括激发能量及其通过非光合猝灭的快速放松和状态转换组分的耗散之间的微妙平衡。更具热耐受性的B. minutum藻株(B1-B1o-B1g-B1p)表现出增强的脱环氧化作用，与类囊体膜的熔点强烈相关，并可能通过膜加固将氧化损伤最小化。该研究深入理解了在密切相关的B. minutum藻株中支撑热耐受性的光保护机制。研究还探讨了在热应激下，不同B. minutum藻株的光合作用参数变化，包括光系统II的最大光合效率(Fv/Fm)、实际量子产量(ΔF/Fm′)、非光化学淬灭(NPQ)以及ROS的产生。通过主成分分析（PCA）和不同的统计测试，研究揭示了不同藻株在热应激下的光生理响应差异。文章还讨论了在热应激下，B. minutum藻株的光保护机制的动态变化，包括快速放松的NPQ(qE型)、慢放松的NPQ(qI型)、以及状态转换(qT1和qT2型)。该研究的结果与之前观察到的它们的宿主Exaiptasia diaphana的热漂白耐受性一致，强调了在面对快速短期热应激时，不同藻株采取了不同的光合作用策略。
Rewiring photosynthesis by water-soluble fullerene derivatives for solar-powered electricity generation (Advanced Science, IF=15.1)
光合作用将光能转变为化学能是自然界中最重要的能量转化过程。光反应通过光氧化裂解水，产生大量高能态电子，经光合电子传递链生成还原力NADPH和ATP，用于暗反应生物固碳反应。利用生物元件或人工元件改变光合电子传递方向，有望提高生物光电转化效率，用于生物光伏、光驱生物制造、光合产氢等系统。然而，天然光合系统和细胞代谢调控非常复杂，传统生物工程策略难以实现光合电子传递过程的改造和调控。2024年4月22日，中国科学院微生物研究所李寅团队的朱华伟博士与国家纳米科学中心贺涛研究员合作，在Advanced Science杂志上发表题为Rewiring photosynthesis by water-soluble fullerene derivatives for solar-powered electricity generation的研究论文。文章提出了一种改变光合电子传递方向的新策略，即利用零维碳纳米材料从光合电子传递链中截流电子并传递到胞外，从而提高生物光电转化效率。研究人员设计合成了一种表面带正电荷的水溶性富勒烯纳米材料，该纳米材料被蓝藻细胞捕获后，可以改变光合电子传递方向，促进光合电子向胞外分流，将光电流密度提高一个数量级。
那么，富勒烯衍生物是如何促进蓝藻的电子外排过程呢？研究人员采用特异性电子传递抑制剂进行分析，发现在正常蓝藻细胞中，光合电子主要从光系统 I 上游（特别是从质体醌池处）分流到胞外。当蓝藻细胞吸收富勒烯衍生物后，光合电子则主要从光系统 I 下游，特别是铁氧化还原蛋白即 Fd 处分流，表明富勒烯在光合电子传递链上的作用位点主要位于光系统 I 受体侧。飞秒瞬态吸收光谱和稳态荧光光谱分析进一步揭示出，富勒烯衍生物与光系统II和光系统I的光反应中心均存在直接相互作用。除了富勒烯衍生物 C60-DMePyI 之外，研究人员还分析了其他几种不同功能化富勒烯纳米材料对光电流产生的影响，以及这些纳米材料的 Zeta 电位﹑吸收效率和氧化还原特性。结果表明，富勒烯改变光合电子传递方向的作用主要取决于其表面电荷和氧化还原特性。带正电荷的富勒烯表面有助于与带负电的细胞膜相互作用。同时，纳米材料在水相体系中的可逆氧化还原特性是其发挥电子载体功能的关键因素。综合这些结果表明，表面带正电荷的水溶性富勒烯衍生物能够与蓝藻细胞光合电子传递链中的氧化还原中心发生相互作用，改变光合电子的传递方向，促使光合电子从蓝藻细胞中溢出，从而提高蓝藻细胞的光电流。该研究不仅有助于深入认识蓝藻细胞中光合电子传递的屏障，也为打开三维电子载体富勒烯纳米材料在生物能量转化中的应用提供了可能。
Photosynthetic control at the cytochrome b6f complex (The Plant Cell, IF=11.6)
光合生物可以吸收和利用光能，但是不能储存光能，因此它们必须谨慎地平衡这些代谢物的生成和消耗。如果光反应和CBB循环的速率不匹配，光照过强时会形成活性氧(ROS)导致细胞损伤，光照受限时则会导致细胞性能下降和生长受限。调节光反应的一个重要机制是光合控制(PCON)，它在NADPH和ATP的生成超过CO2固定需求的条件下，通过维持高ΔpH对电子-质子转移反应进行反馈调节。PCON通过调节电子传递速率，保护光系统I(PSI)免受光诱导损害。在波动光照环境中进行的实验证明，PCON是植物生长和恢复能力的必要条件，缺乏该过程的突变体会遭受PSI的严重破坏。
PCON是一种防御性保护机制，它通过维持线性电子传递(LET)产生的NADPH和ATP与二氧化碳(CO2)固定反应消耗速率之间的平衡，有效避免了光能对光系统I(PSI)的潜在损害。对植物来讲，在绝大多数情况下都是要优先考虑如何保护 PSI的，因为植物缺乏专门针对PSⅠ的快速修复循环，这意味着任何损伤都会导致长时间的光抑制和生长衰退。LET与CO2固定反应之间的不平衡可通过跨类囊体膜ΔpH水平来感知，当光照过量时，ΔpH会升高。PCON的典型机制体现在通过ΔpH对细胞色素b6f中线性电子传递(LET)的质体醌(PQH2)氧化步骤进行的反馈调控。PCON通过此机制保持了光系统I (PSI)的特殊配对叶绿素(P700)的氧化状态，这使得在CO2固定反应中未使用的多余电子能够通过电荷重组被安全地淬灭。2024年4月26日，英国谢菲尔德大学Matthew P Johnson实验室的Gustaf E Degen在The Plant Cell杂志发表题为Photosynthetic control at the cytochrome b6f complex的研究性综述文章，作者以被子植物为研究对象，探讨了PSI光氧化损伤是如何产生的，PSI光抑制对光合作用和生长的影响，讨论了在了解PCON调节方面的最新进展，最后展望了未来在作物中利用 PCON提高光合效率的前景。
与依赖于ΔpH的qE不同，其动态变化对光强度变化表现出滞后效应，P700的氧化过程却能极其迅速地放松。实际上，在拟南芥植物上使用快速振荡的正弦波型光照机制表明， qE基本上无法快速且准确地跟踪光照强度的变化，但PCON的响应性要强得多。这表明，通过操纵qE的放松速率来更好地跟踪光照强度变化，从而成功提高作物产量的转基因方法对于P700氧化来说是不必要的。然而，在狗尾草(Setaria viridis)和拟南芥中，ISP亚基的过表达，从而提高细胞色素b6f复合物的水平，已被证明能在强光条件下增加生长和CO2同化作用，这表明增加流向PSI的电子流可以增强光合作用。事实上，狗尾草ISP过表达株系显示出比野生型更高的PSI产量和更低的PSI氧化水平，但生长速度更快。同样，表达藻类细胞色素c6：细胞色素b6f和PSI之间Pc的替代电子载体，也能增加生长。因此，重新调整细胞色素b6f对ΔpH的敏感性，可能使该系统对电子流的阻力降低，这可能与下游电子汇的操控协同作用，例如通过过表达CBB循环中的限速酶来改善作物生长。
P700氧化(Y(ND))对于避免PSI光抑制的重要性是显而易见的。然而，传统意义上的光抑制(即细胞色素b6f对电子流的阻力仅随ΔpH变化)并不总是起作用的，因为KP700或P700red t½通常不会随光照强度的增加而变化。相反，电子阻力是恒定的，因此Y(ND)反映了Cytb6f对LET 速率的固有限制，尽管这种限制没有改变。这突出了PCON和Y(ND)之间的明显区别。因此，要确定PCON的变化，需要PSI的再还原率(P700red t½)，甚至更精确地说，要确定Cytb6f阻力的变化，应测量Cyt fredt½或Pc还原半衰期(Pcredt½)。通过这些更精确的测量方法可以观察到，如果ΔpH下降到阈值以下(如在pgr5和渗入解耦剂的植物中观察到的那样)，PCON就会下降；如果细胞色素b6f ISP发生变化，PCON就会增加。然而，在低CO2等胁迫条件下，除了阈值ΔpH外，还需要其他因素来诱导PCON。已经提出了几种氧化还原和基于结构的PCON额外调节机制，现在应该进一步进行实验验证。
参考文献
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5. Deore, P., et al. (2024). "Unique photosynthetic strategies employed by closely related Breviolum minutum strains under rapid short-term cumulative heat stress." Journal of Experimental Botany. [IMAGING-PAM]
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7. Degen, G. E. and M. P. Johnson (2024). "Photosynthetic control at the cytochrome b6f complex." The Plant Cell. [DUAL-KLAS-NIR & DUAL-PAM-100 &P515/535]
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