数字PCR助力胃癌的潜在诊断生物标志物筛查
数字PCR（dPCR）是一种核酸绝对定量的技术，与传统的荧光定量PCR技术（qPCR）相比，dPCR拥有可以精确到单个核酸分子的高精准度、适合复杂样本的高便捷度、且无需标准曲线或参照基因进行对比分析等特点。因此，高灵敏度、绝对定量、高稳定性和更高的抗干扰能力成为数字PCR的4大优势。
作为最常见的肿瘤之一，胃癌(GC)具有高死亡率，因为当前的检查方法不能实现早期诊断。核粒梭菌(Fn)主要定居在口腔中，据报道与胃肠道肿瘤的发展有关。迄今为止，关于唾液Fn和胃癌之间的关系知之甚少。该篇来自山东大学齐鲁医院文章确定唾液Fn能否作为诊断胃癌的生物标志物，并探讨Fn对胃癌细胞的影响。
实验方法：通过液滴数字聚合酶链反应对2019年1月至2020年12月山东大学齐鲁医院的120例GC患者、31例萎缩性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常对照(NC)的唾液中Fn的丰度进行定量。进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，以评估Fn以及传统血清肿瘤标志物(包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA) 19-9和CA72-4)的诊断价值。Transwell实验和伤口愈合实验评估Fn感染对GC细胞的影响。western blot法检测上皮间质转化(EMT)标记物的表达。
★实验流程：
- 研究人员的样本收集，120例GC患者、31例萎缩性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常对照(NC)的唾液样本的收集，离心后储存在-80℃。
- 使用凯杰QIAamp Blood Mini Kit试剂盒提取200ul唾液样本中的基因组DNA，浓度用Qubit 3荧光计测定。
- 使用上海小海龟数字PCR仪进行Fn的测定，设计Fn的探针进行检测。
- GC细胞的培养，Fn的菌株培养
- 将GC细胞和Fn的菌株共培养，进行感染
- 将感染后的GC细胞进行Transwell分析
- 伤口愈合实验，感染后的GC细胞进行Transwell分析，感染后用200 μL的移液管尖端进行直线刮擦，模拟伤口，随后，除去培养基和漂浮细胞，用无血清培养基代替，并捕获图像。细胞培养48小时后，再次拍摄图像。
- Western blot分析，将感染Fn和未感染Fn的GC细胞裂解进行Western blot分析
实验结果：核粒梭菌(Fn)是一种牙周致病菌，常见于胃肠道肿瘤组织中。在此，研究发现胃癌患者唾液Fn水平升高，可作为胃癌诊断的潜在生物标志物，其诊断能力优于传统的血清肿瘤标志物。研究还发现唾液Fn水平与胃癌TNM分期和淋巴结转移呈正相关。此外，实验在试管内揭示了Fn通过促进上皮-间质转化过程来促进GC细胞的迁移和侵袭。该发现表明唾液Fn是诊断胃癌的潜在生物标志物。该研究表明唾液中Fn含量可作为诊断胃癌的生物标志物，Fn感染可通过加速上皮间质转化过程促进胃癌转移。
