微生物实验室菌种管理及保存方法详解

微生物实验室如果从事致病菌检测、培养基质控验收、方法验证等相关工作，就应该备有标准菌株。实验室需对使用的标准菌株进行规范性管理，以便有效地、安全地使用，保证实验结果的准确性。

一、实验室应建立菌种管理制度

内容包括菌种申购、保管、领用、使用、传代、存储等方面的内容，标准菌种申购应由专人申购，保管由专人双人双锁管理，领用及使用应填写记录，使用时应对菌种进行纯度及生化特性进行菌种核查验证并记录，存储应有专门的冰箱、超低温冰箱进行存储，使用完的菌株应按要求销毁处理。

二、实验室根据需求购买相应的标准菌株

购买标准菌株应从有资质的机构进行购买，到货的标准菌株应包括菌种证明，后面附有菌种质控报告。收到菌种时应仔细阅读菌种证明，核实到货的菌种与申购的是否一致，包装是否完整，注意保存条件及有效期，并将菌种放置相应的条件下进行储存(一般在活化前储存于4℃冰箱中)。核实后及时填写菌种清单，菌种清单应包括菌种名称、菌种编号、到货日期、储存条件、购买数量、领用日期、领用人、销毁日期等。

三、实验室建立菌种传代图

菌种传代图记录简洁清晰，记录内容包括菌种名称、菌种编号、到货日期、菌种完整性、菌种活化日期、活化方法(主要包括活化使用的培养基及培养温度)、活化数量、保藏条件，保存数量、领用人、传代日期、传代数量、菌种用途、销毁日期等。菌种在活化后及每次使用时都应对菌株纯度、菌落形态(在选择培养基上的典型菌落)、生化特性(如氧化酶试验、三糖铁试验等)、表型分析(用VITEK 鉴定)进行核查并记录，以保证菌种使用的有效性。

四、菌种保藏方法

菌种保藏方法可依据标准SN/T2660-2010《食品微生物实验室菌种保藏方法》进行保存。建议实验室购买-80℃超低温冰箱，选择甘油保存法，甘油保存方法操作方便，保存时间较长。菌株使用过程中应在生物安全柜中进行，遵循无菌操作以防菌种污染。使用完的菌种应按生物安全要求，在121℃高压灭菌30min，并做好菌种销毁记录。

实验室菌株管理是小事，然而却是重要的事。他直接影响着实验结果的准确性，不容忽视哦!

为了避免微生物死亡、污染，保持其原有性状基本稳定，便于研究和使用，需要用到菌种保藏技术。以下介绍一些常见的菌种保存的方法。

1、低温冷冻保藏法

该方法适合大多数需要长期保存的微生物，病毒等。原理为在超低温环境下时，微生物代谢活动停止，一般温度越低效果越好。

使用冻存管对菌种进行保存，同时需要保护剂，一般使用甘油、脱脂羊粉或者二甲亚砜等保护剂。讲含有菌种的冻存管置于-60~-80℃冰箱中冷冻保存。

2、液体石蜡保藏法

液体石蜡保藏法适用于一些不能分解石蜡的菌类，例如酵母菌、芽孢杆菌属、青霉属、曲霉属等，一些细菌和真菌并不适合用该方法进行保存。液体石蜡法使用液体石蜡覆盖，微生物代谢被抑制，菌种老化推迟。石蜡法可以防止氧气进入，使得需氧菌无法继续生长，同时若培养基水分蒸发，容易导致细菌死亡，石蜡法可防止培养基水分蒸发，延长菌种保存时间。
 
无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面顶端1cm~2cm，加胶塞并用固体石蜡封口，使菌种与空气隔绝。将注人石蜡油的菌种斜面直立存放于低温（4℃~6℃）干燥处或室温下保存。

3、冷冻干燥保藏法

该方法适合大多数微生物的保存，但不适用于不产孢子的丝状真菌。冷冻干燥保藏法是在低温、干燥、缺氧条件下保藏菌种。即在低温条件下快速地将菌种冻结，使微生物保持完整，然后减压抽直空使冰升华直至脱水干燥，并在直空状态密封隔绝空气，使微生物代谢活动停止，得以长期保藏。

按照一定配方配置保护剂加入安瓿管，然后再加入菌种制备成菌悬液。先将安瓿管进行预冻存至-15~-20℃，然后用冷冻真空干燥机对安瓿管进行干燥，并将安瓿管进行熔封。低温避光保存。

4、沙土管保藏法

该方法适合用于产孢类放线菌、芽孢杆菌等的保存，不适合以菌丝发育为主的真菌和病原性真菌的保藏。使用细沙土创造干燥条件，使那些能够产生孢子或芽孢的微生物在干燥环境中的代谢活动减缓，抑制其繁殖速度，且抵抗力强不易死亡。该方法能减少菌株突变，延长存活时间。
将河、海沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中右机物较多可用20%盐酸浸泡。24h后倒去盐酸，用自来水浸泡数次至中性，将沙子烘于或晒干。另取未被污染的地表以下十壤用100日讨筛，自来水洗至中性，烘干。按沙：土=2：1混合均匀，分装人安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压灭菌1h~1.5h，或常压间歇灭菌3次、每天每次16。在50℃以下烘干（温度不宜过高，否则土壤有机质被高温分解后，产生有害物质，影响菌种性能），经检查无微生物生长方可使用。

之后制备菌悬液并将菌悬液加入沙土管中。讲含有菌悬液的沙土管放入真空干燥器中进行真空干燥。使用火焰封融管口，存放于低温（4℃~10℃）或常温干燥处，定期检查活力及杂菌情况。

5、瓷珠保存法

市面上通常有便于使用的瓷珠保存管成品，用于低温保存菌种。瓷珠保存管通常由一根冻存管，以及内部的保存液和瓷珠构成。表面凹凸的瓷珠用于细菌的吸附和保存。可在-20℃或-80℃下对菌种进行长期保存。不管是在保存还是在复苏接种时，操作都更加简便。

从平板上刮取细菌纯培养物于菌种保存管中，大致配置成3-4个麦氏浓度。摇晃使得细菌乳化，将保存液洗干净后拧紧保存管，低温冻存。