PCR反应条件的控制要点

PCR反应条件的控制要点

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 

2.  镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

　　
3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。

　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

　　
5.  引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。

　
6.  反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30 s。

（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。