无血清细胞冻存液冻存复苏操作步骤

细胞冻存是细胞培养技术中细胞进行保种并长期保存的常用方法，其中细胞冻存液，作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，不仅仅是说只是用来进行细胞的保存，在细胞的购买、寄赠、交换和运送过程中也起着关键作用，因此选择一款好的细胞冻存液就尤为重要。

无血清细胞冻存液是指不含血清和动物源成分的细胞冻存液，对比传统细胞冻存液存在的优势：

1.是一种通用型的细胞冻存液，可用于冻存人和各种动物细胞株；

2.完全冻存液配方，即开即用，方便快捷；

3.非程序降温，-80℃低温冰箱长期冻存，也可液氮冻存；

4.特别配方（主要成分为DMSO和氨基酸）具有有效提高细胞冻存活率和复苏活力；

5.不含动物来源性蛋白，能减少各类病毒、霉菌和支原体等的污染，确保冻存细胞安全；

6.可孔板（细胞培养板）冻存，可用于杂交瘤细胞的冻存液.

无血清细胞冻存液操作步骤，简单、方便：

一、细胞冷冻保存方法：

选择冻存处于对数生长期的细胞有助于提高复苏细胞存活率。

冻存管冻存方式：

1、按照常用方法收集悬浮细胞或贴壁细胞于试管中。

2、按照培养细胞密度和所用细胞冻存管的尺寸计算所需冻存细胞数。（参考：5×105至5×106cells/ml）。

3、取相当于所需细胞数的细胞悬浮液量，置于离心管中，离心收集培养细胞（参考离心条件：1,000~2,000rpm，4℃，3~5min）。移去离心管中的上清液。

4、加入适量无血清细胞冻存液于离心管中，使细胞浓度为5×105至5×106cells/ml。缓慢混合均匀，制成细胞混合液。

5、将离心管中的细胞混合液分装于已标示的冷冻保存管中。

6、直接将含细胞悬液的冻存管放入-80℃冰箱，冷冻保存。

7、若研究者需要液氮保存时，可先放入-80℃冰箱过夜后，再移至-196℃液氮罐。

原位冻存方式：

1、从培养状态良好的细胞培养板中将培养基上清吸取干净。

2、加入适量无血清细胞冻存液于培养孔板中，充分浸润细胞。

3、盖上盖板，做好密封措施，防止染菌。

4、直接将含冻存液的细胞培养板放入-80℃冰箱，冷冻保存。

二、冻存细胞复苏方法

冻存管复苏方式：

1、从冰箱取出冻存细胞管，立即放入37℃水浴槽中快速解冻。

2、待冻存的细胞悬液完全融化后，立即加入1ml细胞培养基于该冷冻管中与细胞混合，再将细胞混合液从冻存管中移入含有9ml该细胞培养基的试管中，混合均匀。

3、离心收集培养细胞（参考离心条件：1,000~2,000rpm，4℃，3~5min），移去上清液。

4、清洗细胞，充分洗净残留冻存液。

5、加入适量新鲜培养基，使用移液管缓缓地均匀细胞混合液。适量地稀释后，将细胞混合液移至事先准备好的培养瓶中。

6、镜检后，研究者可根据各自方法和需要来进行细胞培养。

原位复苏方式：

1、从冰箱取出冻存培养板，立即放入37℃水浴槽中快速解冻。

2、待冻存的细胞悬液完全融化后，轻轻吸去细胞冻存液，按照常规换液操作加入新鲜培养基继续进行培养。