AML12小鼠肝细胞的培养步骤及应用
一、细胞简介：
细胞名称：AML12小鼠肝细胞
平台编号:zl-056994
细胞特性
1）来源：小鼠，肝
2）形态：上皮样细胞
3）含量：>1x106个/mL
4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
二、细胞培养步骤
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM/F12基础培养基；优质胎牛血清，10%；10ug/mL胰岛素；转铁蛋白5.5ug/mL;5ng/mL硒;40ng/mL地塞米松;双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
三、用于载铅超细炭黑对CAT、SOD及小鼠肝细胞毒性效应与机理的研究
选取小鼠原代肝细胞为靶细胞,选取CAT和SOD为靶蛋白,选取UFCB作为UFPs的生物替代模型,在细胞水平和分子水平研究比对了UFCB和载铅UFCB诱发机体氧化应激的效应与机理。
主要包括以下几部分内容:（1）综述了大气颗粒物、UFPs、UFCB和铅的污染现状及现阶段毒理学研究进展,明确了现阶段对载铅UFPs毒性机理评价的不足,确定了本次的研究目的和研究内容。
（2）利用多种方法对UFCB进行改性修饰,改性后超细炭黑（MCB）水溶液的Zeta电位为-39.7mV,远高于改性之前的-18.2mV,证明MCB的分散稳定性优于改性之前。将MCB应用于铅的吸附实验,最后得到铅含量为0.235g/g的载铅MCB（即Pb-MCB）。
（3）研究比对了MCB和Pb-MCB诱发小鼠肝细胞氧化应激效应的影响。实验结果表明:肝细胞活力与MCB和Pb-MCB暴露浓度之间均呈负活力-剂量关系。细胞内MDA含量随MCB和Pb-MCB暴露浓度的增加而升高,且在50mg/L时达到最高,分别为对照组的204.44%和172.49%,高浓度的MDA打破了细胞内部的氧化还原平衡并破坏了细胞膜的完整性,使细胞发生脂质过氧化作用从而导致细胞活力降低甚至死亡。随着MCB和Pb-MCB暴露浓度的升高,细胞内CAT的相对活力均呈先上升后下降的趋势。MCB的暴露同样导致了胞内SOD的相对活性先上升后下降,但是随Pb-MCB暴露浓度的增加,SOD的相对活性逐步上升。比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对小鼠肝细胞氧化应激指标的影响发现,MCB的细胞毒性较Pb-MCB的细胞毒性强,原因是MCB较Pb-MCB带更多的负电荷,更易与膜蛋白、CAT和SOD结合作用,影响细胞和酶的活力及功能表达。
（4）利用多种光谱学手段研究比对了MCB和Pb-MCB的暴露对CAT和SOD分子结构和功能的影响。结果发现:无论是MCB还是Pb-MCB都会与CAT和SOD结合,在炭黑颗粒表面形成一层“蛋白冠”类的物质,改变了CAT和SOD发色团的微环境,使蛋白质骨架结构紧缩,疏水性增强。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持续下降。CAT和SOD活性的变化一方面说明了结构的改变影响了酶的功能表达;另一方面酶与MCB或Pb-MCB的结合会影响其活性位点附近氨基酸的微环境,从而间接对酶的活性产生影响或者抑制作用。
比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对CAT和SOD分子的影响时发现,MCB对CAT和SOD结构和功能的影响大于Pb-MCB对两种酶蛋白的影响,原因是MCB带大量的负电荷,更易与带正电荷的CAT或者SOD结合作用,改变酶蛋白的结构使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促进了Pb-MCB粒子的团聚沉降,粒径的增大使Pb-MCB与酶蛋白之间的作用力和结合面积减小,因此MCB较Pb-MCB表现出更强的分子毒性。
细胞名称：AML12小鼠肝细胞
平台编号:zl-056994
细胞特性
1）来源：小鼠，肝
2）形态：上皮样细胞
3）含量：>1x106个/mL
4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
二、细胞培养步骤
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM/F12基础培养基；优质胎牛血清，10%；10ug/mL胰岛素；转铁蛋白5.5ug/mL;5ng/mL硒;40ng/mL地塞米松;双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
三、用于载铅超细炭黑对CAT、SOD及小鼠肝细胞毒性效应与机理的研究
选取小鼠原代肝细胞为靶细胞,选取CAT和SOD为靶蛋白,选取UFCB作为UFPs的生物替代模型,在细胞水平和分子水平研究比对了UFCB和载铅UFCB诱发机体氧化应激的效应与机理。
主要包括以下几部分内容:（1）综述了大气颗粒物、UFPs、UFCB和铅的污染现状及现阶段毒理学研究进展,明确了现阶段对载铅UFPs毒性机理评价的不足,确定了本次的研究目的和研究内容。
（2）利用多种方法对UFCB进行改性修饰,改性后超细炭黑（MCB）水溶液的Zeta电位为-39.7mV,远高于改性之前的-18.2mV,证明MCB的分散稳定性优于改性之前。将MCB应用于铅的吸附实验,最后得到铅含量为0.235g/g的载铅MCB（即Pb-MCB）。
（3）研究比对了MCB和Pb-MCB诱发小鼠肝细胞氧化应激效应的影响。实验结果表明:肝细胞活力与MCB和Pb-MCB暴露浓度之间均呈负活力-剂量关系。细胞内MDA含量随MCB和Pb-MCB暴露浓度的增加而升高,且在50mg/L时达到最高,分别为对照组的204.44%和172.49%,高浓度的MDA打破了细胞内部的氧化还原平衡并破坏了细胞膜的完整性,使细胞发生脂质过氧化作用从而导致细胞活力降低甚至死亡。随着MCB和Pb-MCB暴露浓度的升高,细胞内CAT的相对活力均呈先上升后下降的趋势。MCB的暴露同样导致了胞内SOD的相对活性先上升后下降,但是随Pb-MCB暴露浓度的增加,SOD的相对活性逐步上升。比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对小鼠肝细胞氧化应激指标的影响发现,MCB的细胞毒性较Pb-MCB的细胞毒性强,原因是MCB较Pb-MCB带更多的负电荷,更易与膜蛋白、CAT和SOD结合作用,影响细胞和酶的活力及功能表达。
（4）利用多种光谱学手段研究比对了MCB和Pb-MCB的暴露对CAT和SOD分子结构和功能的影响。结果发现:无论是MCB还是Pb-MCB都会与CAT和SOD结合,在炭黑颗粒表面形成一层“蛋白冠”类的物质,改变了CAT和SOD发色团的微环境,使蛋白质骨架结构紧缩,疏水性增强。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持续下降。CAT和SOD活性的变化一方面说明了结构的改变影响了酶的功能表达;另一方面酶与MCB或Pb-MCB的结合会影响其活性位点附近氨基酸的微环境,从而间接对酶的活性产生影响或者抑制作用。
比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对CAT和SOD分子的影响时发现,MCB对CAT和SOD结构和功能的影响大于Pb-MCB对两种酶蛋白的影响,原因是MCB带大量的负电荷,更易与带正电荷的CAT或者SOD结合作用,改变酶蛋白的结构使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促进了Pb-MCB粒子的团聚沉降,粒径的增大使Pb-MCB与酶蛋白之间的作用力和结合面积减小,因此MCB较Pb-MCB表现出更强的分子毒性。
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