质粒的提取和纯化

 　　 质粒（Plasmid）是独立于染色体外的环状DNA分子，大小通常在1-200Kb不等，可依赖宿主细胞中的酶和蛋白质进行独立地复制和转录。

　　  质粒是独立于染色体基因组的DNA。按照质粒的拷贝数量，通常把质粒分严紧型质粒和松弛型质粒。严紧型质粒：染色体复制一次，质粒也复制一次，每个细菌内只含1-2个质粒；松弛型质粒：当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。

　　  为了适应更多复杂的分子克隆实验，在天然质粒的基础上，人们构建出具有不同特性的质粒载体。质粒载体通常具有以下几个特点：具有较小的分子量、可插入较大分子量的目标序列、具有多种常用的限制性内切酶酶切位点，同时具有检测表型（耐药性等）。

　　  典型的质粒载体通常具有复制起始点Ori（下方蓝色方形）、筛选标记（红色区域）以及多克隆酶切位点MCS（右侧蓝色区域）

　　  预备知识Ⅱ：分离纯化的原理

　　  质粒纯化的过程实际上是将质粒与染色体基因组、蛋白质等其他成分分离的过程。在细菌体内，质粒是以共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的形式存在。碱裂解法是实验室提取质粒最常用的方法之一，该方法的原理是利用线性的染色体DNA与闭合环状质粒DNA在拓扑学上的差异来实现分离。

　　  共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)结构示意图，在细菌中，cccDNA通常以超螺旋的形式存在

　　  实验操作中，我们通常应用溶菌酶和阴离子表面按活性剂SDS（十二烷基磺酸钠）来处理收集到的菌体。在溶菌酶的作用下，细菌的细胞壁破裂并释放出质粒。在pH12-12.5这个狭窄的范围内，线性染色体DNA的双螺旋会解开，质粒DNA的氢键也会断裂。然而，质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条链依然互补缠绕，紧密结合。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，SDS可包被在这些大型复合物表面上。当加入乙酸甲使溶液恢复中性时，两种DNA均可迅速复性，但是复性的精准度有所差别：cccDNA由于互补链在形体上始终保持在一起，复性迅速而准确。随机断裂的线性DNA彼此分离，复性既不迅速也不准确，会聚集成网状结构。通过离心，染色体DNA会与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA会留在上清液中。再用异丙醇或乙醇洗涤，会得到比较纯的质粒DNA。

　　  质粒提取与纯化操作指南

　　  质粒的提取和纯化主要包含三个步骤：①培养细菌，扩增质粒；②收集并裂解细菌；③分离并纯化质粒。目前，试剂厂商已经开发出多种多样的商品化DNA提取试剂盒，这些试剂盒中几乎都包含三种基本的溶液：溶液Ⅰ（葡萄糖、Tris·Cl(pH8.0)、EDTA(pH8.0)）、溶液Ⅱ（NaOH，1%SDS）和溶液Ⅲ这三种溶液分别起到悬浮菌体、破碎细胞以及中和的作用。实验中一般会使用异丙醇沉淀质粒，70%的乙醇洗涤质粒。提取好的质粒的可以保存在含有RNA酶的TE缓冲液中。