人成巨核细胞白血病细胞的处理方法及应用
一、细胞简介：
细胞名称：人成巨核细胞白血病细胞MEG-01/(STR鉴定正确）
智立编码：20211259101220138
MEG-01人成巨核细胞白血病细胞源自一位CML患者成巨核细胞转换期的骨髓细胞。细胞质因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反应，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶阳性。髓过氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和碱性磷酸酶阴性。用单克隆抗体BA-1(抗B细胞，粒性白细胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗单核细胞，血小板)染色成阳性。其他淋巴和骨髓类抗体成阴性。
二、培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培养液的新皿中或者瓶中。
三、应用
用于MicroRNA-223调控急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗后血小板反应性的机制研究：
通过建立氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞的实验模型,使得氯吡格雷可以直接在体外完成代谢活化并进行细胞实验,并利用该细胞模型相关实验与相关临床研究,对氯吡格雷治疗低反应的机制的进行了更深一步的探讨。
MicroRNA-223与急性缺血性卒中患者血小板ADP受体P2Y12和氯吡格雷反应性的相关性分析目的：探讨急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗前后血小板膜蛋白P2Y12表达水平与血小板反应性的关系,以及miR-223在其中的调控作用。方法：采用流式细胞术检测急性缺血性卒中患者治疗前后ADP诱导血小板聚集率,通过血小板相对抑制率及八分位数法筛选出低反应组和高反应组,检测极端病例治疗前后血小板中P2Y12蛋白表达水平,并比较分析其在两组极端病例中的差异;构建病毒载体感染人成巨核细胞白血病细胞MEG-01,下调miR-223水平,观察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表达变化。
结果：在急性缺血性卒中患者中,无论在治疗前水平还是治疗后水平,血小板P2Y12的蛋白表达水平与血小板聚集率均呈显著正相关（p<0.05）。高反应组治疗后较治疗前P2Y12蛋白表达水平有所降低,但无统计学意义（p=0.073）。
低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的改变程度较高反应组显著减低（1.14604vs0.77097,p=0.031）。通过构建病毒载体感染下调MEG-01细胞中miR-223水平,可以显著升高P2Y12mRNA水平和蛋白水平的表达。
结论：氯吡格雷低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的相对降低程度较高反应组显著减低;在人血小板前体细胞中,miR-223可以调控ADP受体蛋白P2Y12的表达。
氯吡格雷肝微粒体孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞模型的建立及其对miR-223表达的影响目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞MEG-01的细胞处理模型,并探讨氯吡格雷孵育液处理对miR-223表达所产生的影响,为从细胞水平探索氯吡格雷治疗对人体血小板所产生影响提供新的方法学依据。
方法：利用毒理学研究方法,以肝微粒体和氯吡格雷在适宜体系条件下共同孵育,获得含有氯吡格雷活性代谢产物的孵育液。观察不同浓度梯度和不同时间节点氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞后P2Y12蛋白水平的表达变化,确定细胞模型最佳处理浓度和时间,观察细胞中miR-223表达变化。
结果：在低（100ul/2ml）、高（200ul/2ml）两种浓度下氯吡格雷孵育液处理MEG-01细胞后,P2Y12蛋白表达均无显著变化（p>0.05）。在以200ul/2ml的浓度连续处理5天的条件下,氯吡格雷孵育液组细胞膜P2Y12蛋白表达较对照肝微粒体孵育液组显著降低42.6%（p<0.01）。在以200ul/2ml的浓度分别连续处理3天、5天后,氯吡格雷孵育液处理的MEG-01细胞中miR-223表达分别下降了47.3%和32%（p值均<0.05）。
细胞名称：人成巨核细胞白血病细胞MEG-01/(STR鉴定正确）
智立编码：20211259101220138
MEG-01人成巨核细胞白血病细胞源自一位CML患者成巨核细胞转换期的骨髓细胞。细胞质因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反应，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶阳性。髓过氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和碱性磷酸酶阴性。用单克隆抗体BA-1(抗B细胞，粒性白细胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗单核细胞，血小板)染色成阳性。其他淋巴和骨髓类抗体成阴性。
二、培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培养液的新皿中或者瓶中。
三、应用
用于MicroRNA-223调控急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗后血小板反应性的机制研究：
通过建立氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞的实验模型,使得氯吡格雷可以直接在体外完成代谢活化并进行细胞实验,并利用该细胞模型相关实验与相关临床研究,对氯吡格雷治疗低反应的机制的进行了更深一步的探讨。
MicroRNA-223与急性缺血性卒中患者血小板ADP受体P2Y12和氯吡格雷反应性的相关性分析目的：探讨急性缺血性卒中患者氯吡格雷治疗前后血小板膜蛋白P2Y12表达水平与血小板反应性的关系,以及miR-223在其中的调控作用。方法：采用流式细胞术检测急性缺血性卒中患者治疗前后ADP诱导血小板聚集率,通过血小板相对抑制率及八分位数法筛选出低反应组和高反应组,检测极端病例治疗前后血小板中P2Y12蛋白表达水平,并比较分析其在两组极端病例中的差异;构建病毒载体感染人成巨核细胞白血病细胞MEG-01,下调miR-223水平,观察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表达变化。
结果：在急性缺血性卒中患者中,无论在治疗前水平还是治疗后水平,血小板P2Y12的蛋白表达水平与血小板聚集率均呈显著正相关（p<0.05）。高反应组治疗后较治疗前P2Y12蛋白表达水平有所降低,但无统计学意义（p=0.073）。
低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的改变程度较高反应组显著减低（1.14604vs0.77097,p=0.031）。通过构建病毒载体感染下调MEG-01细胞中miR-223水平,可以显著升高P2Y12mRNA水平和蛋白水平的表达。
结论：氯吡格雷低反应组治疗前后血小板P2Y12蛋白表达的相对降低程度较高反应组显著减低;在人血小板前体细胞中,miR-223可以调控ADP受体蛋白P2Y12的表达。
氯吡格雷肝微粒体孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞模型的建立及其对miR-223表达的影响目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液处理人成巨核细胞白血病细胞MEG-01的细胞处理模型,并探讨氯吡格雷孵育液处理对miR-223表达所产生的影响,为从细胞水平探索氯吡格雷治疗对人体血小板所产生影响提供新的方法学依据。
方法：利用毒理学研究方法,以肝微粒体和氯吡格雷在适宜体系条件下共同孵育,获得含有氯吡格雷活性代谢产物的孵育液。观察不同浓度梯度和不同时间节点氯吡格雷肝微粒体孵育液处理MEG-01细胞后P2Y12蛋白水平的表达变化,确定细胞模型最佳处理浓度和时间,观察细胞中miR-223表达变化。
结果：在低（100ul/2ml）、高（200ul/2ml）两种浓度下氯吡格雷孵育液处理MEG-01细胞后,P2Y12蛋白表达均无显著变化（p>0.05）。在以200ul/2ml的浓度连续处理5天的条件下,氯吡格雷孵育液组细胞膜P2Y12蛋白表达较对照肝微粒体孵育液组显著降低42.6%（p<0.01）。在以200ul/2ml的浓度分别连续处理3天、5天后,氯吡格雷孵育液处理的MEG-01细胞中miR-223表达分别下降了47.3%和32%（p值均<0.05）。
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