汇总RT-PCR需注意的细节

RT-PCR就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。

RT-PCR需注意的细节

1. 实验过程中必须戴口罩、手套，尽量避免其他人员干扰。

2. RT试剂盒从冰箱拿出，应该充分解冻，瞬离后，混匀，放于冰上，可在冰上加样。试剂可以用数字贴纸编号，避免漏加、错加试剂。

3. 取用不同的试剂时，必须更换枪头，样本之间要避免交叉污染。

4. 逆转录时，PCR仪可以先预热。

5. 反应体系配好之后，应充分混匀，瞬离，并且弹去管内的气泡。

6. 实验过程中应预防RNA酶污染，使用无酶枪头以及EP管，同时台面可以使用固相RNA酶去除剂清洁。

7. PCR时，管壁尽量避免写字。

8. 管盖一定要盖严。

9. 10μL逆转录反应体系建议加入不超过500ng的RNA。

10. 如果目的基因表达量非常低,最多加入1μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。

11. 反应体积可根据需要等比例放大。

12. 试剂尽量不要反复冻融。

13. 每个样品至少3个平行孔,所有成分加完后，离心去除气泡。

14. 可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中。