食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法！
一、主题内容与适用范围
本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。
本文适用于航空食品的检验。
二、设备和材料
吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等。
三、培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV 培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、 Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-proskauer（V-P）试剂。
四、样品制备
⒈以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
⒉制备样品匀液
以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。
⒊稀释样品匀液
用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。
五、大肠菌群的测定
⒈大肠菌群MPN值的测定
⑴对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤，每管接种1ml。
⑵将接种管置于36±1℃的培养48±2h。
⑶观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
⒉大肠菌群的证实试验
⑴将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。
⑵置BGLB肉汤管于36±1℃的培养48±2h。
⑶记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
⑷结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。
六、粪大肠菌群测定
⒈用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
⒉将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
⒊记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
⒋结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。
七、大肠杆菌测定
⒈将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1℃的培养24±2h。
⒉检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
⒊如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃的培养18-24h。
⒋将斜面培养物移种到下列培养基进行生化试验。
⑴色氨酸肉汤：在36±1℃的培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml，上层出现红色为靛基质阳性反应。
⑵MR-VP培养基：在36±1℃的培养48±2h后。以无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm试管中，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将 MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
⑶Korser氏枸掾酸盐肉汤：于36±1℃的培养96h记录有无生长。
⑷ LST肉汤：于36±1℃的培养48±2h，观察试管中是否产气。
⑸革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
⑹大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
⒌结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。
本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。
本文适用于航空食品的检验。
二、设备和材料
吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等。
三、培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV 培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、 Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-proskauer（V-P）试剂。
四、样品制备
⒈以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
⒉制备样品匀液
以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。
⒊稀释样品匀液
用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。
五、大肠菌群的测定
⒈大肠菌群MPN值的测定
⑴对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤，每管接种1ml。
⑵将接种管置于36±1℃的培养48±2h。
⑶观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
⒉大肠菌群的证实试验
⑴将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。
⑵置BGLB肉汤管于36±1℃的培养48±2h。
⑶记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
⑷结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。
六、粪大肠菌群测定
⒈用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
⒉将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
⒊记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
⒋结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。
七、大肠杆菌测定
⒈将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1℃的培养24±2h。
⒉检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
⒊如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃的培养18-24h。
⒋将斜面培养物移种到下列培养基进行生化试验。
⑴色氨酸肉汤：在36±1℃的培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml，上层出现红色为靛基质阳性反应。
⑵MR-VP培养基：在36±1℃的培养48±2h后。以无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm试管中，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将 MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
⑶Korser氏枸掾酸盐肉汤：于36±1℃的培养96h记录有无生长。
⑷ LST肉汤：于36±1℃的培养48±2h，观察试管中是否产气。
⑸革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
⑹大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
⒌结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。
