检测黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 使用说明书

AC-SEP®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱

（产品编号：IAC103）

使用对象

IAC-SEP®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱能够特异性的纯化与浓缩样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。黄曲霉毒素免疫亲和柱广泛地应用于粮食、食品、饲料、坚果、花生、酱油、醋、辣椒、胡椒、药材和酒类等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对准确灵敏的测定样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2起到十分重要的作用。

IAC-SEP®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱适用于以下标准：

GB/T 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

SN/T 1101-2002 进出口油籽及粮谷中黄曲霉毒素的检测方法

原理

样品经甲醇+水提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有黄曲霉毒素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，黄曲霉毒素被亲和柱中的抗体特异性的吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将黄曲霉毒素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或荧光计进行定量检测。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均匀。

        甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均匀。

HPLC流动相，甲醇/水（45+55）：取450mL甲醇加550mL水，混合均匀，用0.22微米的尼龙筛过滤。

标准溶液的配制：取黄曲霉毒素混标（G1010，B1和G1为1.0ug/mL,B2和G2为0.3ug/mL），流动相为稀释液，配制标准品溶液。例如：取100uL标准品原液于10mL容量瓶中，用10mL流动相定容至10mL，那么，黄曲霉毒素B1和G1为10ng/mL，黄曲霉毒素B2和G2为3ng/mL.

               注：配制好的标准品溶液2-8℃冷藏保存有效期为24h。

pH 7.0 PBS溶液：称取8.0g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

0.1%的吐温/PBS：将1.0mL吐温-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混匀。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流动相：甲醇-水（45+55，v/v）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器，激发波长360nm,发射波长440nm

进样体积：20~100uL

光化学衍生化系统：光化学衍生器（连接于色谱柱后，然后通向荧光检测器）

分析步骤

1. 样品提取及稀释：

大米、玉米、小麦、坚果、调料、花生及其制品：准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入125.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取15.0mL滤液并加入30.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

植物油脂：准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及入125.0mL甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取15.0mL滤液并加入30.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

酱油：称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL，以均质器高速搅拌提取1min。槽纹滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

食醋：准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL，混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL滤液加入10.0mL pH7.0磷酸盐缓冲溶液，混匀。以玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

饲料：准确称取试样50.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及入100.0mL甲醇-水（8+2），以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL pH7.0 PBS稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

1. 样品的净化

   黄曲霉毒素总量免疫亲和柱的柱容量(最大吸附黄曲霉毒素量)为300ng，当样品中黄曲霉毒素超过测定范围时，请适当减小上柱体积，使其在检测范围内，计算出准确含量。

大米、玉米、小麦、坚果、调料、花生及其制品、植物油脂：（测定范围0-300 μg/kg）

    将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

酱油和食醋：（测定范围0-300 μg/kg）

 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

饲料：（测定范围0-300 μg/kg）

将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

高效液相色谱仪检测黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2的标准谱图

注意事项

1. 样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2小时后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。
2. 不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。
3. 操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。
4. 如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过25%，否则会影响柱子的吸附能力。
5. 试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。

需要准备的设备及试剂（中检维康提供）