正常角膜内皮细胞培养

正常角膜内皮细胞培养

实验材料：

1. 角膜材料：可以取自人眼、兔眼或者牛眼，人眼材料最好来自胎儿；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 特殊器械：虹膜恢复器；

4. 消毒液：1：5000的升汞溶液与100IU/ml的庆大霉素生理盐水；

5. 消化液：0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合溶液；

6. 培养液：基础液由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO32.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。应用液是在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，并用5% NaHCO3调节pH至7.0—7.2；

实验方法：

1. 切取角膜内皮层组织：以人眼为材料培养角膜上皮细胞时，最好取自胎儿的眼角膜。因为成年人眼角膜细胞在体外培养时，生长活力不如胎儿眼角膜细胞；

1） 摘取眼球1只，用升汞溶液与庆大霉素生理盐水消毒液交替冲洗2次，以洗去眼球表面残留的血污并作初步消毒处理；

2） 无菌条件下，于角膜缘内侧1mm处作一环形小切口；

3） 用虹膜恢复器从切口处插入后弹力膜与角膜基质（实质层）之间，顺角膜弧度钝性分离去除整个角膜实质层；

4） 待角膜上皮层被完全分离之后，沿角巩膜缘内侧1mm处环形剪下全周内皮层组织；

2. 接种与培养；

1） 将所取的内皮层组织放在培养皿中，加入2—3滴牛血清；

2） 用角膜剪将其剪成约1.5mm×1.5mm大小的组织块；

3） 用无齿小镊子将组织块内皮面朝下平贴接种于培养瓶中；

4） 在培养箱中静置20—60min，待植块牢固黏附后，再加入足量培养液；

5） 按常规方法培养。每周换液2次；