QPCR

二、操作步骤

1、RNA提取 对于贴壁细胞样本 （1）用移液器小心吸去培养基，加入1mL 4℃预冷的PBS溶液，小心摇晃洗去残余培养基，用移液器吸尽PBS溶液，加入1mL Trizol溶液，反复吹打培养瓶/培养基底部及四周，将细胞充分吹打到Trizol中。加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 对于悬浮细胞样本 （1）低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，300g离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入1mL Trizol溶液，反复吹打将细胞充分吹打到Trizol中加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 对于组织样本 （1）标本于-80℃或液氮中保存，用已经消毒的工具于冰上取约100mg组织，于1mL 预冷的Trizol中充分研磨，匀浆液小心倒入1.5mL EP管中，加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。 （2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL 于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。 （3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。 对于血液样本 （1）取500μL全血于15mL离心管中，加入10倍体积红细胞裂解液，混匀，室温避光静置10min。 （2）室温，300g，离心10min，弃上清，重复步骤（1），室温，300g，离心10min，弃上清。 （3）PBS重悬细胞沉淀，室温，300g，离心10min，弃上清，100μL PBS重悬细胞，加入1mL Trizol，混匀，静置5min，加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。 （4）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL 于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。 （5）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。   2、第一链cDNA合成 第一链cDNA的合成采用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser进行（TaKaRa公司），主要步骤如下： （1）在冰上配置如下反应液，以除去基因组DNA。 试剂 使用量 5*gDNA Eraser Buffer 2.0 μL gDNA Eraser 1.0 μL RNA 10.0μL   PCR仪上42℃ 2 min         4℃ （2）在冰上配置如下反应液 试剂 使用量 步骤1反应液 PrieScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL RT Primer Mix 1.0 μL 5*PrimrScript Buffer 2 4.0 μL RNase Free dH2O 4.0 μL   PCR仪上37℃ 15 min                                   85℃ 5 sec                                    4℃ 3、荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOne™ Real-Time PCR仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒进行（TaKaRa公司）： （1）反应程序为：预变性 95℃，1min 循环（40次） 95℃，15s→58℃，20s→72℃，45s 熔解曲线 60℃→95℃，每20s升温1℃   （2）反应体系为： 试剂 使用量 2× qPCR Mix 5.0 μL 引物工作液（2.5μM） 1.0 μL Template 1.0 μL ddH2O 2.8 μL Rox 0.2 μL

三、附录
1、数据分析方法
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，实验样本)- CT(内标基因，实验样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2^-K
2、引物
（1）引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成
（2）序列如下：

引物名称		引物序列	产物长度（bp）
	Forward	5`--3`
	reverse	5`--3`
		5`--3`
		5`--3`

武汉恒意赛生物科技有限公司坐落于武汉光谷国际生物医药产业园，拥有独立的细胞培养室以及SPF级动物房，致力形态病理学、细胞生物学、分子生物学、蛋白免疫学、模式动物等在科研中的推广和应用，专业从事分子、蛋白、细胞领域相关产品的引进和研发。自成立至今，公司团队成员已参与了多个医学生物研究课题和国家自然科学基金、项目。以多年科研立项、评估、科研转化的经验，为广大科研工作者的课题提供专业的服务，并与全国多家企业以及科研机构建立合作关系为每一位科研工作者提供最优质、最高效的实验服务。