16S/18S/ITS 扩增子测序

 16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（constant region）。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起到重要作用。
18S rDNA或ITS（Internal Transcribed Spacer）被广泛应用在真菌分类鉴定中。18S rDNA在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类；ITS属于中度保守区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。

研究内容
16S/18S/ITS扩增子测序即通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的某一或某几个区，使用Illumina测序将目的区域正反向读通，通过检测目的区域的序列变异和丰度，对环境样本物种分类及，丰度，种群结构，系统进化，群落比较等方面信息进行分析的研究方法。

产品优势
策略多样：不同来源样本采用不同提取方法和建库测序策略，满足多种环境研究需求。
平台多样：MiSeq/HiSeq2500/PacBio等多种平台可供选择，可满足16S/18S/ITS不同高变区域或全长测序的需求。
经验丰富：已测序样品类型涉及粪便、土壤、水体、唾液、牙菌斑、体腔、胃液、白带、空气、血液、皮屑等。
分析自动化：自动化分析平台，可多次提交不同的信息分析方案，客户可以主导信息分析过程。
售前、售后服务：提供结题报告解读视频及其他个性化售前售后服务。
样本需求量低：华大基因16S产品推荐DNA样本量50ng以上；对于样本获取困难的样本，只要样本量高于0ng也有可能建库成功。
数据交付指标高：华大基因对16S产品承诺交付clean tags（用于后续OTU/物种分析的有效数据量），承诺100%满足合同数据量。常见的16S数据交付指标有raw reads、clean reads、raw tags，clean tags等，受数据质量和目标区域长度的影响，一般的数据利用率（clean reads/raw reads）和拼接率（clean tags/clean reads）会在50%~100%之间波动。

应用范围
医学领域：人体微生物与人体健康/疾病的关系，人体微生物对疾病干预过程的影响；
动物领域：肠道、瘤胃（如产甲烷菌类群）与动物健康/营养消化研究等；
农业领域：根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等；
环境领域：雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等；
特殊极端环境：极端环境条件下的微生物类群研究，如冰川、火山等。

 技术流程
取质量合格的基因组DNA样品30ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，设置对应的PCR反应参数进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行纯化，完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小选择合适的平台（HiSeq/MiSeq）进行测序。下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。

 建库流程
16S/18S/ITS扩增子建库推荐融合引物建库方法，即提前合成融合了目标序列引物和上机接头、index等序列的引物，通过一步PCR扩增直接完成建库。主要步骤如下：
样品检测：使用Qubit对样品浓度进行精确定量，检测合格的样品进行文库构建。
PCR体系构建：取30ng DNA样品及融合引物配置PCR反应体系。
PCR扩增：设置PCR反应参数进行PCR扩增。
产物纯化：使用磁珠进行纯化，文库构建完成。
文库质量检测：文库检测使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库的片段范围及浓度。
上机测序：文库检测合格，上机测序 
测序策略

	扩增区域	引物名称	引物对
细菌	V4	515F	GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
		806R	GGACTACHVGGGTWTCTAAT
	V1-V3	8F	AGAGTTTGATYMTGGCTCAG
		518R	ATTACCGCGGCTGCTGG
	V3-V4	338F	ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
		806R	GGACTACHVGGGTWTCTAAT
	V4-V5	515F	GTGCCAGCMGCCGCGG
		909R	CCGTCAATTCMTTTRAGT
真菌	ITS1	its1	CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
		its2	GCTGCGTTCTTCATCGATGC
	ITS2	its3	GCATCGATGAAGAACGCAGC
		its4	TCCTCCGCTTATTGATATGC

*注：只有两端完全测通的Reads (Tags)才能用于进一步的分析，目前短读长测序最长测序读长为PE300，片段范围在530以上的建议选择长读长测序来做。

信息分析内容
下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。

分析模块	信息分析条款
数据处理	数据过滤
	Reads拼接
OTU聚类及分析	OTU统计
	OTU venn图分析
	Core-Pan OTU分析
	OTU PCA分析
	OTU NMDS分析
	物种累计曲线分析
	OTU PLS-DA分析
	OTU Rank 曲线
物种分类	物种丰度柱状图（多方案展示）
	物种丰度热图（多方案）
	物种系统发育进化分析
	GraPhlAn 物种组成图
	物种PCA分析(样本≥ 3)
	菌群分型分析样本（肠道样本）
单个样品多样性分析（alpha多样性）	Alpha多样性统计表（包括observed species指数（sobs）、chao1指数、ace指数、shannon指数和simpson指数）
	Alpha多样性稀释曲线（多方案）
	Alpha多样性盒形图
样品间多样性比较分析（beta多样性）	Beta多样性热图（Bray-Curtis，weighted UniFrac，unweighted UniFrac）
	样品聚类树
	PCoA
	UPGMA 聚类树与丰度组合图
	Beta多样性指数组间差异分析（分组≥2，每组样本数≥3）
物种差异分析（分组≥2，每组样本数≥3）	LEfSe分析
	Wilcox Test
	Kruskal Test
	相似性分析检验分析（Analysis of similarity，ANOSIM）
	PERMANOVA/Adonis分析（如关注物种与表型的关联需提供表型信息，否则默认分析物种与分组关联）
	关键物种差异比较柱状图
功能分析	KEGG功能预测
	KEGG对应酶的编号及通路图
	COG 功能预测
	功能差异分析（Wilcox Test、STAMP）
关联分析与模型预测（个性化分析）	CCA/RDA分析（需提供详细的环境因子数据）
	Spearman相关系数分析（需提供表型信息）
	物种间相关系数网络图分析
	随机森林--ROC曲线（分组=2，每组样本数≥30）
	SourceTracker （需要提供样本来源信息）

华大科技于2012年完成整合，致力于成为全球生命科学研究机构的首选科技服务商，为从事生命科学研究的机构和企业提供高质量、行业领先的基因测序、质谱、合成生物学、生物数据库、云计算等标准化的技术服务和综合的全流程解决方案。 目前，公司服务已经覆盖了全球100多个国家和地区，拥有7,000多位合作单位，为25,000多位行业联系人提供了杰出技术支撑与服务，更通过深度合作完成了一系列大型基因组科研计划和国际多边合作项目。科研积累上，截至2020年9月底，公司累计参与发表近1,500篇文章，其中CNNS 120+。截止2022年3月，华大自主测序平台DNBSEQTM 助力发表2,013+篇高质量文章，影响因子合计8,800+，并实现CNS三大主刊发文。