全外显子测序

全外显子测序 （Whole-exome sequencing，WES）是高频应用基因组测序方法。外显子是人基因组的蛋白编码区域，利用序列捕获技术可以将其DNA捕获并且富集。虽然外显子区域仅占全基因组1%左右[1]，却包含了85%的致病突变[2]。相比全基因组测序，全外显子测序更加经济、高效。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异与疾病的关系。

技术优势

1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异
2. 高深度测序，可发现变异频率低于1%的罕见变异
3. 仅针对外显子组区域，有效降低测序费用、存储空间和工作量

产品应用
相比于全基因组测序，外显子区域占比小（约1%），因此更容易做到更高深度测序，检测到更多低频和罕见变异，同时也能降低测序费用和存储空间。外显子测序，50M的捕获区域，测序数据量10-12Gb就可以得到100X的有效测序深度。这个特性决定了外显子测序在遗传性疾病和肿瘤研究中的重要作用，特别是做肿瘤异质性研究。由于肿瘤异质性，肿瘤内部有很多亚克隆，有些亚克隆的占比很低，应用外显子高深度测序可以更快、更经济地检测出普通测序深度难以发现的体细胞突变。

图1 外显子测序产品应用

         华大基因采用Agilent等液相捕获系统，对人的全外显子组区域的DNA进行高效捕获富集，然后提供基于DNBSEQTM测序技术的捕获测序服务。建库和杂交实验采用官方指定试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照经过优化的实验流程进行操作。如下为DNBSEQTM外显子测序技术流程。

图2 DNBSEQTM平台外显子建库流程

测序原理
DNBSEQTM平台外显子测序产品 ，采用先进的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，提供一站式、开放性的基因测序全面解决方案，具备精准、简易、快速、灵活、可拓展等优点，既能充分适用临床检测，也能满足更广泛的科研需求。该测序平台产品的外显子数据均一性好、单个碱基质量值高。该平台有五大关键的技术：DNB、Pattern array、cPAS、MDA-PE、sCMOS，保证了该平台测序的准确性。

 

图3 DNBSEQTM平台优势

        首先，单链环状 DNA 分子通过滚环复制，线性扩增2-3个数量级，增强信号。所产生的扩增产物称为DNA纳米球（DNA nanoball, DNB），采用高密度DNA纳米芯片技术，将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内（固定在阵列化的硅芯片上）。通过联合探针锚定聚合技术（cPAS）和多重置换扩增的双末端测序法（MDA-PE）得到读长为100bp/150bp的双末端序列。

图4 DNA 纳米球示意图

       MDA-PE的具体原理是：完成第一链（Forward Strand）测序后，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，合成第二链（Reverse Strand），并通过DNA分子锚，进行第二链的测序。MDA-PE法具有合成快、准确度高等优点。与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：

•  DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度。
• 不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积。
• DNB与芯片上的网状小孔大小相同，每个小孔只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰。
• 阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到充分利用。

信息分析
信息分析从测序的下机数据（raw data）开始，原始下机数据过滤掉接头、低质量碱基、未测出的碱基（以 N 表示）后比对到参考基因组上，进行SNP检测和InDel或者CNV分析，然后通过数据库注释，对变异检测的结果通过基于变异有害性、样本情况和基因功能表型三种分析策略，筛选出于疾病相关的有害性位点或基因。另外, 为了保证高质量的测序数据，在整个分析流程中设置了严格的数据质控体系（QC）。

图6 肿瘤信息分析内容

产品优势

1. 捕获平台：Agilent v6芯片和IDT等多种探针选择
2. 测序平台：单链滚环复制，更少PCR扩增错误引入
3. 质量卓越：DNBSEQ的变异检测一致性高，对InDel检测灵敏度更高，更适合高深度的肿瘤研究
4. 项目经验：发表国内第一篇外显子测序文章，项目经验10年＋，平台稳定
5. 广泛合作：大学、医院、科研院所、制药公司合作超过6000次，样品总数16万+

参考文献

1. Ng SB1, Turner EH., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature.461(7261):272-6.

2. Choi M1,Scholl UI., et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.Proc Natl Acad Sci USA. 106(45):19096-101.

华大科技于2012年完成整合，致力于成为全球生命科学研究机构的首选科技服务商，为从事生命科学研究的机构和企业提供高质量、行业领先的基因测序、质谱、合成生物学、生物数据库、云计算等标准化的技术服务和综合的全流程解决方案。 目前，公司服务已经覆盖了全球100多个国家和地区，拥有7,000多位合作单位，为25,000多位行业联系人提供了杰出技术支撑与服务，更通过深度合作完成了一系列大型基因组科研计划和国际多边合作项目。科研积累上，截至2020年9月底，公司累计参与发表近1,500篇文章，其中CNNS 120+。截止2022年3月，华大自主测序平台DNBSEQTM 助力发表2,013+篇高质量文章，影响因子合计8,800+，并实现CNS三大主刊发文。