组织细胞环状DNA测序

环状DNA简介
游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA, 而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。
传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但最新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。近日，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于环状DNA的，而环状DNA的染色质是高度开放的，环状DNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得环状DNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，环状DNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，环状DNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来革命性影响。

 

环状DNA形成的机理

目前研究表明，环状DNA是从染色体上断裂、环化或者额外复制产生的序列，其剪切加工机理主要提出有两种可能：（1）通过染色体异位同源重组环化（intrachromatid ectopic homologous recombination，HR）；（2）通过非同源染色体末端连接环化（nonhomologous end-joining，NHEJ）。环状DNA形成是一个复杂的过程，更多环化方式有待探索。
组织细胞环状DNA测序服务

云序组织细胞环状DNA测序服务（Circle-seq），采用多种方法高效地富集和扩增环状DNA，极大地提高了环状DNA的检出率。富集后，通过NGS测序高通量地检测细胞中所有的环状DNA分子。并通过严谨的环状DNA生信流程，实现了对环状DNA准确的识别和详细的基因注释。

 

云序优势
环状DNA检出率高：
采用多种方法高效地富集环状DNA，环状DNA检出率高。
专业的生物信息学分析：
专业的生物信息学团队，开发了高效识别分析环状DNA的算法，满足客户的各类深入数据分析需求。
一站式服务：
客户只需提供细胞、组织或基因组DNA，云序生物为您完成从样品准备、环状DNA富集、文库制备、上机测序到数据分析整套服务流程。
 

样本要求
样品类型：
细胞、组织、基因组DNA。其它类型样品请详询。
样品量：
a）细胞 2×107
b）组织 200 mg
c）DNA：>=10 µg，溶于无菌水或 TE（PH = 8）（OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染）。
样品运输及保存：
样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。
样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可-20℃，避免反复冻融。
 

数据分析（下列有 * 表示个性化分析）

1.环状DNA注释表格
测序后首先可以得到一个详尽的环状DNA注释表格，列出每个样品中检测到的每个环状DNA所在的染色体、坐标，长度，表达丰度，相关基因注释, GO注释，Pathway注释等。
2.长度分布
对整体或单独样本中的环状DNA的长度进行统计和展示。
3.组间共有和特有环状DNA*
对不同分组中共有和特有的环状DNA个数的统计和展示。
4.环状DNA差异表
不同的样品分组间可以进行环状DNA丰度的差异比较，通过差异倍数、p值、关联基因筛选关键的环状DNA。
5.差异环状DNA聚类图、散点图、火山图
展示不同样品分组间环状DNA的丰度差异。
6.差异环状DNA所属基因的功能分析
对环状DNA或差异环状DNA所属基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。

 

7.染色体分布*

对整体或单独样本中的环状DNA在各染色体上的数量、密度进行统计和展示。

  

 

 

 

8.环状DNA在基因组的分布*
环状DNA在不同基因区域、重复序列元件区域分布。

9.联合转录组关联分析*
如果联合全转录组测序，可以将环状DNA与mRNA进行联合分析寻找相关性。 案例解析
案例1：环状DNA促进染色质的开放和促癌基因的表达
原文：Wu, S., Turner, K.M., Nguyen, N. et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) .
期刊：Nature 影响因子：43.07
研究团队首先结合二代全基因组测序和光学匹配（optical mapping），从序列的角度发现，扩增出来的环状DNA形成了环状结构,不仅证实了肿瘤中的环状DNA确实是环状的，还证明了环状DNA的染色质是高度开放的，从而进一步阐释了环状DNA能大量表达癌基因和其环状结构介导的超远距离相互作用，这也表明了环状DNA可能形成了新的基因调控回路和在驱动肿瘤异质性的机制研究中发挥着重大的作用。

 

 

 

案例2：癌基因与邻近增强子的环化共扩增
原文：Morton AR, Dogan-Artun N, Faber ZJ, et al. Functional enhancers shape extrachromosomal oncogene amplifications. Cell. 2019 Nov 27;179(6):1330-1341
期刊：Cell 影响因子：36.22
本文作者利用染色体外环状DNA测序探讨了癌基因及其邻近增强子通过环状染色体外DNA的形式进行扩增事件，研究过程中发现了EGFR基因在成胶质细胞瘤中存在与其上游约130kb的非编码序列共同扩增的特征，EGFR基因案例表明肿瘤细胞中的癌基因通过高级扩增与环化而形成的对自身调控活性的增强，是一个十分有效的促癌机制。总之，这项研究综合利用各项计算分析和实验手段，首次揭示了增强子在癌基因环化扩增介导的促癌效应中所发挥的重要作用，这一机制也为抗肿瘤和诊断提供新的方向和理论依据。

 

 

 

上海云序生物科技有限公司于2015年成立，坐落于上海漕河泾新兴技术开发区，专注于表观修饰以及转录组领域，依托于高通量测序、定量PCR、质谱技术和生物信息学等核心技术，集科研服务、医学检测、产品研发于一体的创新技术企业。
云序生物聚焦科研前沿领域，是国内率先开展RNA修饰，转录组及eccDNA研究的创新性企业，提供各类RNA修饰，各类RNA分子（mRNA及非编码RNA），各类测序技术（IP类，单碱基类）及eccDNA系统性解决方案。云序作为国内表观修饰&转录组领域的领军者，拥有一支具有国际水准的生物信息分析团队，不仅可以提供标准化的生物信息分析，还提供个性化的深度数据挖掘，与众多学术机构建立了合作关系，合作单位包括超过300家科研院所和高校、200余家医院等，目前已成功完成人、动植物、原核生物等在内的数百个物种；组织、细胞、血清、血浆、胎盘、视网膜，房水等不同种类型，累计上万个样本的实验及数据分析服务，参与的研究成果在各大国际顶级期刊发表数百篇，影响因子累积10000+。