哮喘模型

1.小鼠过敏性哮喘模型
BALB/c小鼠于第0天和第14天分别腹腔注射0.1mL/只OVA液(0.2 mg/mL)和DBP溶液（0.5 mg/kg），第21~23天连续3天以0.5%的OVA溶液雾化激发，每天于上午下午固定时间雾化2次，每次20min。雾化过程中观察小鼠一般行为变化，最后一次雾化结束后24小时，小鼠摘眼球取血，取支气管肺泡灌洗液( Bronchial Alveolar Lavage, BALF )及肺组织。
一般行为学观察  观察小鼠在雾化过程中是否出现挠脸、毛发竖立、呼吸急促、烦躁不安、大小便失禁等现象。
血中Eos计数    最后一次雾化激发结束24h后，小鼠摘眼球取血，获得血液后立即取出20 μl与380μl 嗜酸性粒细胞稀释液混匀，利用细胞计数板于光学 显微镜下进行Eos计数。
血清中IgE测定   将获得的血液静置2h后，离心，3500 rpm，15min，取血清，按IgE ELISA试剂盒说明书进行测定，并通过样本总蛋白含量进行结果校正。
BALF细胞分类计数  将小鼠仰卧位固定，打开胸腔后，结扎右肺及左侧肺上叶。分离并暴露气管，用适宜针头进行气管插管，以预冷PBS反复灌洗肺组织（0.5 mL/次，共两次），收集BALF，低温离心( 3500 rpm，10min )，取上清，保存于-20℃待测。细胞沉淀用0.2 mL预冷PBS重悬，吹打均匀后取10 μl于细胞计数板上在光学显微镜下计细胞总数，剩余细胞悬液涂片，用快速瑞姬氏染液染色，显微镜下进行细胞分类计数。
BALF中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ的测定  将获得的BALF上清根据相关细胞因子检测试剂盒的说明书进行各指标定量检测，测定结果经总蛋白含量校正。
肺组织中IL-4和IFN-γ的测定  将右侧肺组织用预冷的PBS研磨得15 % 组织匀浆，低温离心，3500 rpm，15min，取上清按照 ELISA 测定试剂盒的操作步骤进行IL-4和IFN-γ测定，并通过样本总蛋白定量来进行校正。
肺组织HE及PAS染色  剪取左肺上叶，置10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋，常规石蜡包埋，切片，HE及PAS染色，镜下观察肺组织炎性细胞浸润及黏性蛋白增生情况。
 
2.枸橼酸诱发豚鼠咳嗽实验
取体重200-260 g豚鼠，雌雄各半，置于500 mL的观察室内，以恒定压力喷入17.5%的枸橼酸，喷雾1 min，观察并记录豚鼠在5 min之内的咳嗽潜伏期和咳嗽次数，将咳嗽潜伏期≤10 s或≥120 s，以及5 min内咳嗽次数≤10次或者≥50次的豚鼠全部剔除。预选合格的豚鼠经体重随机分层分组，即模型组、咳必清组、各剂量给药组，每组6只。各组连续灌胃给药7天，每天一次，模型组豚鼠灌以等体积生理盐水。末次给药后1 h，按上述筛选条件引咳豚鼠，观察并记录各豚鼠咳嗽潜伏期及5 min内咳嗽次数，并与模型组比较。
 
3.氨水诱发小鼠咳嗽实验
18-22 g ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分层分组，即模型组、咳必清组、各剂量给药组。各组连续灌胃给药7天，每天一次，模型组小鼠灌以等体积生理盐水。末次给药后1 h，将小鼠置于一倒置的容积为500 mL，内置一棉球的烧杯中，在向棉球上滴加0.4 mL浓氨水时开始计时，观察并记录小鼠咳嗽潜伏期和3min内咳嗽次数，并与模型组比较。
 
4.大鼠急性咽炎模型
清洁级SD大鼠，雌雄各半，用喉头喷雾器于大鼠咽部喷体积分数15％氨水， 每次喷 3 揿，相当于6μl 15%氨水停留在大鼠咽部。每天上、下午各 1 次，连续 3 d，造成急性咽炎模型；每日观察记录各组动物外观状态，并观察动物咽部情况，包括黏膜形态、色泽等。
观测指标：
一般状态观察：观察记录大鼠的饮水、饮食、活动、体重、精神状态及被毛等情况，并观察动物咽部情况， 包括黏膜形态、色泽等。
血常规检测：检测白细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞等百分含量
检测血清炎性细胞因子IL-1b、IL-6、TNF-a的水平：末次给药24后，腹主动脉取血，静止2h，离心（3000 rpm，10 min），取上清，-20℃保存，采用ELISA方法检测血清中IL-1b、IL-6、TNF-a的水平。
咽部病理组织学观察：大鼠腹主动脉取血处死后，立即取咽部黏膜及其下组织， 进行肉眼观察，并用体积分数 10％中性福尔马林溶液固定，进行病理组织学观察。
 
5.化痰实验-小鼠酚红排痰
小鼠雌雄各半，按体重随机分为5组，分别为空白组、阳性药组（盐酸氨溴索）、低、中、高剂量组，每组10只。口服液各剂量组小鼠灌胃给以不同剂量药物，给药体积为0.1 mL/10g，空白组小鼠给以等体积蒸馏水，连续给药7天，1次/天；阳性药组小鼠于第5-7天灌胃给予盐酸氨溴索口服溶液30 mg/kg，1次/天。末次给药30 min后，各组小鼠腹腔注射5 %酚红溶液500 mg/kg，30 min后，断颈处死动物，仰位固定。
剪开颈部正中皮肤，分离气管，于喉头下部将平头7号针头插入气管内约0.3 cm，丝线结扎固定，用1 mL注射器吸取5% NaHCO3溶液0.8 mL推注入气管内，反复推抽3次以灌洗气道，共灌洗3次，每次收集0.5 mL灌洗液，合并，约1.5 mL入小试管，离心（2000 r/min， 10 min），取上清液于546 nm处测OD值，代入标准曲线方程，计算各小鼠气管内酚红浓度（μg/mL）。
酚红标准曲线绘制方法: 分析天平准确称量一定量酚红，加5% NaHCO3溶液溶解，配制成酚红含量为20 μg/mL的溶液，然后梯度稀释成15、10、5、3、1、0.7、0.5 μg/mL溶液，酶标仪检测不同浓度酚红溶液在546 nm处OD值，以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并得标准曲线方程。
 

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